GHRP-scu-PA-32K突变体的构建、表达及纯化产物的部分性质研究

北京大学学报（自然科学版）

GHRP-scu-PA-32K突变体的构建、表达及纯化产物的部分性质研究

焦建伟, 徐长法

北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，北京，100871

收稿日期:1999-03-01 出版日期:2000-03-20 发布日期:2000-03-20

Construction, Expression, Purification and Characterization of GHRP-scu-PA-32K

JIAO Jianwei, XU Changfa

National Laboratory of Protein Engineering and Plant Gene Engineering, Peking University, Beijing, 100871

Received:1999-03-01 Online:2000-03-20 Published:2000-03-20

摘要/Abstract

摘要： 在scu-PA-32K的cDNA分子基础上经定点突变，在N端紧接Leu¹之前引入编码GHRP四肽的寡核苷酸序列(GGTCATAGGCCT)，构建了GHRP-scu-PA-32K的突变体cDNA。将它克隆到表达载体pCM-βneo中，与pCMβ-dhfr共转染CHO/DHFR-细胞。筛选到的稳定表达株在无血清培养基的表达量为580IU/(106细胞·24h)。经锌离子螯合亲和柱纯化的产物，SDS-PAGE显示为单一蛋白条带，分子量为33kD，质谱法测定分子量也为33kD。经血纤维蛋白平板法测定比活为150000IU/mg蛋白。对血纤维蛋白的亲和性，突变体为scu-PA-32K的4.5倍。

关键词: 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂, GHRP四肽, CHO细胞, 定点突变

Abstract: GHRP-scu-PA-32K cDNA was obtained by in vitro site-directed-mutagenesis to insert oligonucleotide sequence (GGTCATAGGCCT) encoding tetrapeptide Gly-His-Arg-Pro into scu-PA-32K gene at site just preceding the amino-terminal residue(Leu¹). The mutant cDNA was cloned in pCM-β-neo expression vector and co-transformed CHO-DHFR^- cells together with pCM-dhfr. The stable expression cell line was selected. Expression level of the line cultured in serum-free medium was 580IU/106 cell/24h. The product expressed was purified by Zn²⁺-Sepharose affinity chromatography. The apparent molecular weight of purified GHRP-scu-PA-32K was 33kD by SDS-PAGE and mass spectrometry and its specific activity was 150000IU/mg protein, according to fibrin plate determination. The affinity for fibrin of GHRP-scu-PA-32K was 4.5 times higher than that of scu-PA-32K.

Key words: scu-PA, CHO cell, tetrapeptide GHRP, site-directed mutagenesis

中图分类号:

焦建伟, 徐长法. GHRP-scu-PA-32K突变体的构建、表达及纯化产物的部分性质研究[J]. 北京大学学报（自然科学版）.

JIAO Jianwei,XU Changfa. Construction, Expression, Purification and Characterization of GHRP-scu-PA-32K[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis.

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