杨金水
Jinshui YANG
中图分类号:
X172
通讯作者:
Corresponding authors:
收稿日期:
2015-11-9
修回日期:
2016-01-18
网络出版日期:
2016-09-28
版权声明:
2017 《北京大学学报(自然科学版)》编辑部 《北京大学学报(自然科学版)》编辑部 所有
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摘要 为研究土壤真菌适应不同程度重金属污染的群落组成变化, 以云南省勐糯铅锌矿区土壤样品为研究对象, 通过对其重金属含量和理化性质聚类分析, 选取 5 个重金属高污染和 4 个低污染样品为代表, 提取土壤样品总DNA, 利用Illumina MiSeq测序技术对其进行测序分析, 并在门、纲、目、科、属、种水平上, 分析比较真菌的群落组成变化。研究结果表明, 在高浓度重金属污染样品中, 未被分类真菌占绝对优势, 其次是Aspergillus, Un--s-Clavulinaceae sp.及Un--s-fungal sp. ARIZ L453等。污染低的样品中未被分类真菌也含有较高丰度, 但低于高污染样品, 其次是 Geastrum, Aspergillus 和 Mortierella 等。利用代表性差异分析技术(RDA)分析重金属对土壤真菌多样性的影响, 发现Pb含量对微生物群落结构具有极显著影响。研究结果可为寻找表征重金属污染程度的“核心微生物”奠定一定的理论及实验基础。
关键词：
Abstract Heavy metal contamination is one of the most concerned global environmental problems and the soil heavy metal contamination is especially severe in lead-zinc mining areas in China. In order to study the soil fungal community composition changes responding to different degree of heavy metal pollution, soil samples from the lead-zinc mine field of Yunnan Mengnuo were studied. 5 samples from the heavy metal pollution soil (HP) and other 4 from the low pollution (LP), based on the cluster analysis of heavy metal contents and the physical and chemical properties of the sample were analyzed. Genomic DNA of the soil samples were extracted and the Internal Transcribed Spacer (ITS) genes were sequenced by the high-through sequencing Illumina MiSeq. The fungal communities at different taxonomic levels (Phylum, Class, Order, Family, Genus and Species) were compared. In HP samples, the abundance of unclassified fungi were the highest, then followed by Aspergillus, Un--s-Clavulinaceae sp. and Un--s-fungal sp. ARIZ L453 respectively. In LP samples, the unclassify fungi were also high, but less than HP. The relative abundance of fungi from high to low was Geastrum, Aspergillus and Mortierella. The Representational Difference Analysis (RDA) showed that different heavy metals influence fungal community diversity and the concentrations of Pb was significantly correlated with fungal community.
Keywords：
随着工业的发展, 重金属通过多种途径进入土壤和环境中[1]。重金属作为土壤污染的常见污染物, 不仅破坏自然生态平衡, 影响农业生产, 而且通过食物链积累, 危害人类健康[2]。因此, 重金属污染引起的环境生态问题日益受到关注[3], 其治理也刻不容缓[4]。土壤微生物是土壤的重要组成部分, 重金属污染一方面影响土壤微生物的群落组成及数量, 另一方面, 微生物通过自身的进化与适应, 可通过生物固定、转化、溶解、氧化还原和吸附等作用对重金属进行无害化处理[5], 从而修复污染土壤。在矿区这种长时间受重金属污染的环境中, 存在大量能够抵抗和转化重金属的潜在的高效微生物资源[6], 对于重金属污染土壤中微生物多样性的研究, 有助于揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的相关性[7]。利用微生物群落多样性不仅可以评价与表征重金属污染程度, 而且为抗重金属优良菌种的选育提供依据。传统的分离培养技术不能真实地反应土壤中微生物群落结构[8], 而高通量测序技术能全面深入的分析环境微生物组成, 为土壤微生物的研究提供了可靠的途径。
云南省作为“有色金属王国”[9], 对其铅锌矿区微生物群落结构研究具有典型意义。因此, 本研究在国家地质试验测试中心协助下, 对采自云南省勐糯铅锌矿区的9个土壤样品进行土壤理化性质和重金属含量分析, 并通过内转录间隔区(internal trans-cribed spacer, ITS)高通量测序, 分析其真菌群落组成及多样性, 比较不同程度重金属污染样品的真菌群落结构差异, 为阐明高浓度重金属污染对生态系统的影响, 建立重金属污染检测的生物指标奠定理论及实验基础。
2013 年 8 月, 在云南省勐糯铅锌矿区, 采用多点混合取样的方法, 采集深度0~30 cm处土壤样品9 份, 并记录采样点周边环境和信息。采集后立即将样品装入无菌袋, 及时送回实验室保存。将采集的样品分 3 份保存: 一份存储于-20℃冰箱, 用于分子生物学分析; 一份存储于 4℃, 用于测定土壤酶活性及分离可培养微生物; 一份自然风干, 用于测定重金属含量和土壤理化性质。
由中国地质科学院地质测试中心利用能量色散X射线荧光光谱(EDXRF)分析测定8种常见重金属离子含量, 包括Pb, Cd, Cu, Zn, Hg, Cr, As和Ni[10]。
理化性质参数包括有机质、全氮、有效磷、速效钾、铵态氮、硝态氮及 pH, 由中国农业大学农学院分析测试中心完成。有机质含量测定采用重铬酸钾容量法-稀释热法[11]。有效磷的测定利用0.5 mol/L NaHCO3浸提, 基于钼锑抗比色法[12]。速效钾的测定用 NH4OAc 浸提, 基于火焰光度法[13]。全氮测定基于凯氏定氮法; 土壤NH4+_N的测定利用2 mol/L KCl浸提, 基于靛酚蓝吸光光度法[14]。土壤 NO3--N的测定采用酚二磺酸吸光光度法[15]。pH的测定基于电位法。
利用E.Z.N.A Soil DNA试剂盒(Omega公司)提取土壤样品基因组DNA。
2×Taq PCR StarMix购自北京康润诚业生物 科技有限公司; dNTPs和DNAMaker购自大连TaKaRa公司; 引物由生工生物工程(上海)有限公 司合成; ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′; ITS4: 5′-TCCTCCTCTTATTGATATGC-3′。ITS 序列测定和基本序列信息分析由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成, 每个样品3次重复。
同一个 OTU 中的序列被视为来源于某一个相同分类单元的序列, 作为一个假定的分类单元, cut-off 为 0.03。Uparse 构建 OTUs 时, 会选取代表性序列(依据其算法原则, 筛选的是OTUs中出现频数最高的序列), 将这些代表性序列集合用 Qiime中的Blast方法与Unite_INSDC数据库(Version 2014. 05.13)进行物种注释分析(设定阈值为 0.6~1)。样品之间微生物群落结构的差异采用基于 Bray-Curtis距离的主成分分析(PCA)方法。
9 个土壤样品重金属含量见表 1。将重金属浓度Pb含量低于500 μg/g, Zn含量低于2000 μg/g命名为LP (low pollution), Pb含量大于500 μg/g, Zn含量大于 2000 μg/g 的区域命名为 HP (high pollu-tion)。为了便于统计分析, 将样品Cp5, Mc3, Mc1, Cp3, Es3和样品Es4, Nf5, Ra1, Sd4 分别命名为HP1, HP2, HP3, HP4, HP5和LP1, LP2, LP3, LP4。
表1 样品中8种重金属含量
Table 1 Heavy metal contents in soil samples
9个土壤样品理化性质的测定结果如表 2 所示。每个样品做3个平行测定。
表2 样品理化性质
Table 2 Physical and chemical properties of samples
根据扩增的 ITS1 区域特点, 基于 Illumina MiSeq测序平台[16], 利用双末端测序的方法, 构建小片段文库进行双末端测序。通过对Reads拼接过滤, OTUs聚类, 并进行物种注释及丰度分析, 可以揭示样品的物种构成。进一步的α多样性分析和β多样性分析可以挖掘样品间的物种差异。
2.3.1 样品测序预处理结果及质量检控
将经过标准化预处理后的数据用 Uparse 软件对所有样品的全部 Effective Tags 序列进行聚类, 以 97%的一致性(Identity) 将序列聚类成为 OTUs, 得到的有效 reads 一共 641905 条, 平均每个样品23774条, 其中, 样品Cp3.1最多, 为 40082 条。平均碱基数高达 5615400, 平均片段长度为 237。在cut-off为0.03水平上, OTU数量从最少的Es3.3的217 至最多的 Ra1.2 的 567 之间, 且高污染样品比低污染样品OTU少。
2.3.2 α多样性分析
α 多样性可以表示群落内部或生境内的物种多样性, 通常用Chao 1 和 Shannon指数表示。Chao 1常用来估计物种总数[17], Shannon 指数可以用来描述一个区域的生物多样性。Shannon 值越大, 说明物种丰富度越高。对测序结果的Chao1 和 Shannon指数进行计算, 并进一步计算 HP 区样品和 LP 区样品 OTU 和 Chao 1 的平均值, 结果如图 1 所示。总体上, 随重金属浓度增加, 土壤样品中真菌种类及多样性呈现降低趋势。
图1 HP与LP区OTU, Chao 1和Shannon平均值 Fig. 1 Average value of OTU, Chao 1 and Shannon in HP and LP area
2.3.3 β多样性分析
β 多样性是对不同样品之间微生物群落构成进行比较, 是分析样品间微生物群落差异的重要指标。对9个样品共27个测序样品进行β多样性分析。首先根据所有样品的物种注释结果和OTUs的丰度信息, 在纲水平分类单元进行PCA分析, 结果如图2所示。
纲水平 OTU 的含量和种类聚类主要分为4个区域。说明样品群落多样性主要分为4大群。其中, HP1, HP2, HP3, HP4, HP5和LP1样品的群落结构聚在一起, LP2, LP3和 LP4各自聚在一起。从采样位置的地理描述看, HP5和LP1均位于三江口居民区下大片水稻田, 两者地理位置近, 周边环境相似, LP1 重金属含量与其他 HP 样品的差距也最接近。结果表明: 重金属浓度对微生物群落组成具有重要影响, 当重金属含量超过一定水平后, 影响程度的变化则不显著。
目水平分类单元的 PCA 分析与纲水平的结果相似, 差别只是HP1样品与其他重金属含量较高的样品分开, 其他基本相同。HP1 的重金属含量明显高于其他样品, 说明土壤中重金属浓度确实对真菌群落有重要影响, 而且在越小的分类单元水平上, 重金属污染胁迫对真菌群落的影响越显著。
为了研究不同程度重金属污染土壤样品中真菌的群落结构, 基于 27 个样品在cut-off为 0.03 水平均一化处理后绝对丰度矩阵的OTU, 计算同一样点3 个平行样品 OTU 的平均值。分别在物种相对丰度最高的 5 个门(Ascomycota, Zygomycota, Un--s-fungal sp. ARIZ L453, Basidiomycota, Chytridiomy-cota)水平、9 个纲水平、15 个目水平、25 个科水平、40 个属水平和 50 个种水平上进行真菌群落多样性比较。
2.4.1 门水平真菌多样性
在丰度最高的前5个门水平上分析真菌群落结构多样性, 结果见图3。样品HP1, HP3和HP4中, 未分类真菌为最高相对丰度真菌, 表明在重金属含量高的土壤中, 未分类真菌有较高的丰度。在9个样品整体水平上观察, 子囊菌门在所有门类中占据最高丰度, 这与颜森[18]的结果一致, 其次为担子菌门。此外, 接合菌门和壶菌门也有较高的丰度。
2.4.2 纲水平真菌多样性
在纲水平上真菌群落结构的多样性见图 4。仍然是未分类真菌相对丰度最大, 但 LP 样品丰度远低于 HP 样品, 表明随着分类单元的细化, 未知分类真菌的数量也随之增加。子囊菌门中粪壳菌纲和散囊菌纲在 9 个样品中都具有较高的相对丰度, 说明在铅锌矿区重金属污染土壤中广泛存在。除未分类菌株外, HP1 样品中子囊菌门中座囊菌纲相对丰度最高, 为 11.76%, 远远高于其他样品(1.41%~ 5.37%)。担子菌门的伞菌纲在HP5, LP1 和 LP2 样品中的相对丰度分别为 50.1%, 23.32%和50.18%。所以, 伞菌纲也是重金属污染土壤中的主要真菌, 但其重金属耐受性可能不如座囊菌纲。
2.4.3 目水平真菌多样性
在丰度最高的前 15 个目水平上分析了真菌群落结构多样性, 结果见图 5。在HP1 样点中 Un--s-Sordariomycetes sp. genotype 83所占的比例较高, 在其他样品中分布很低。推测该真菌具有较强的抗重金属能力。散囊菌目为样点 HP2, HP3, LP3 和LP4 中相对丰度较高的菌目, 且为 HP2 样点中的最高相对丰度菌目, 表明散囊菌目在铅锌矿区分布较为广泛, 对重金属的适应能力较强, 因此在多个位点作为最优势菌目出现。
另外, 肉座菌目(Hypocreales)在各个样品中, 特别是在HP2, HP5和LP1中相对丰度较高, 说明该目真菌有较强的适应重金属毒害的能力。Un--s-fungal sp. ARIZ L453在HP4样品中也占有重要比例。HP5 样品中, 鸡油菌目(Cantharellales)相对丰度最大, 占有绝对优势。在 LP2 样品中主要优势真菌集中在地星目和被毛霉目。
通过在目水平上分析真菌群落多样性可以看出, 大部分样品中丰度较高的目比较集中。可以推测, 在重金属污染土壤样品中富集了大致相同的真菌。这可能是因为在长期重金属胁迫环境下, 一些真菌形成较高的抗性能力, 逐渐成为铅锌矿区优势真菌。
2.4.4 科水平真菌多样性
在丰度最高的前 25 个科水平上分析真菌群落结构多样性, 结果见图 6。散囊菌目中的发菌科真菌在HP2, HP3, LP3和 LP4 中有较高的相对丰度; HP1样品中座囊菌纲的假散囊菌科为主要优势真菌; LP2样品中主要优势物种为地星科(Geas-traceae); HP5样品中鸡油菌目的锁瑚菌科(Clavu-linaceae)相对丰度最高; Un--s-fungal sp. ARIZ L453在样点HP4和LP4中相对丰度较高; LP1样品中糙孢孔目(Trechisporales)的丰度最高; LP2中地星目(Geastrales)地星科的丰度最高。
从科水平的分析结果看, 大部分结论与目水平一致, 说明在科水平与目水平之间的主要优势真菌比较集中。
2.4.5 属水平真菌多样性
在丰度最高的前 39 个属水平上分析真菌群落结构多样性, 结果见图 7。HP1, HP3, HP4, LP1, LP3和LP4的相对丰度最高的属仍是未分类真菌。在 HP1 样点中, Un--s-Sordariomycetes sp. genotype83和假散囊菌属(Pseudeurotium)的相对丰度较高; 样点HP2中, 曲霉属(Aspergillus)、Un--s-fungal sp. ARIZ L453和Fusarium为主要优势菌属; HP3样品中, 曲霉属(Aspergillus)相对丰度超过20%; Un--s-fungal sp. ARIZ L453 在样品HP4中超过20%; Un--s-Clavulinaceae sp. 为样品HP5和LP1的优势属; 在样品LP2中, 地星属 (Geastrum)和被孢霉属(Mortierella Ⅰ)为优势菌; LP3样品中, 被孢霉属 (Mortierella Ⅱ)和曲霉属(Aspergillus)为优势菌; Un--s-fungal sp. ARIZ L453和曲霉属(Aspergillus)在LP4中比例较高。
通过在属水平的真菌多样性比较, 能够初步确定各个样品的优势菌属。曲霉在重金属污染样品中的丰度较高, 而且分布较广泛, 之前有报道在铅锌矿区分离过优势菌种曲霉[19], 但在 HP1 样品中含量并不高, 说明不同真菌能够抵抗的重金属浓度有差别。
2.4.6 种水平真菌多样性
在丰度最高的前 50 个种水平上分析真菌群落结构多样性, 结果见图 8。同样是 HP1, HP3 和HP4 中的未分类菌最多, 而且比例超过其他较高级水平分类单位的结果。
除未分类真菌外, 在重金属浓度高的土壤样品中粪壳菌纲的Sordariomycetes sp. Genotype 83种、Schizangiella sp. ARSEF2237、曲霉属的红绶黑曲霉 (Aspergillus nomius)、Un--s-fungal sp. ARIZ L453属的真菌fungal sp. ARIZ L453 和 Un--s-Clavu-linaceae sp. 的 Clavulina sp. 相对丰度较大; 重金属浓度低的土壤中, 地星属的花冠状地星(Geastrum corollinum)和被孢霉属的Mortierella sp. VN2_2_5为优势菌株, 分布较多。另外一些曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)在重金属含量高、低的土壤中均有分布, 只是含量相差很大, 可能是重金属种类对真菌分布也有一定影响。
土壤微生物群落结构受多种因素影响。为了分析不同重金属污染程度和理化性质对微生物群落结构的综合影响, 进行线性模型RDA[20]分析, 结果如图9所示。
在 RDA 排序图内, 环境因子一般用箭头表示, 箭头连线的长度代表某个环境因子与群落分布和种类分布之间的相关程度, 箭头越长, 说明相关性越大, 反之越小。箭头连线与排序轴的夹角代表某个环境因子与排序轴的相关性, 夹角越小, 相关性越高, 反之越低。环境因子之间的夹角为锐角时, 表示两个环境因子之间呈正相关关系, 为钝角时呈负相关关系。RDA 分析表明, Pb 含量对微生物群落结构具有极显著的相关性, TC, Cr和 Cu 与微生物群落结构显著相关。
本研究采用 Illumina MiSeq 测序技术, 对采自云南勐糯铅锌矿区的9个土壤样品中真菌群落组成从门、纲、目、科、属、种不同水平上进行分析, 得到以下结果。
污染程度严重的区域和污染程度较低的区域未分类菌属于优势菌, 但低污染样品中的丰度低于高污染样品, 说明重金属对土壤真菌群落有重要影响, 且土壤重金属含量与真菌的数量负相关, 与李小林等[21]报道的重金属污染程度与土壤微生物数量负相关的结论一致。除未分类真菌外, 高污染样品和低污染样品中的优势真菌种类也不相同。在属水平上, 高浓度重金属污染土壤中主要的优势真菌为Aspergillus, 低浓度重金属污染样品中主要的优势菌为Geastrum, Mortierella及目前研究不多的Un--s-Trechisporales sp.。与杨振兴等[22]对湖南水口山有色金属矿区的优势真菌分析结果相比, 虽然Aspergillus都是优势真菌, 但本研究未发现湖南水口山矿区具有的木霉属菌株, 表明在重金属污染矿区, 不同地理位置矿区的真菌群落结构具有一定的差异性。在种水平上, 高浓度样品中优势菌为Aspergillus nomius, Clavulinaceae sp. 及功能未知的fungal sp. ARIZ L453, 而低浓度样品中Geastrum显著高于高污染样品, Mortierella sp., Trechisporales sp.以及Leotiomycete sp. 7669也明显增多。在纲、目、科水平上的分析结果基本与属和种趋势一致。RDA 分析表明, 土壤中重金属和有机质含量对土壤真菌群落结构具有显著影响, 其中 Pb 含量具有极显著相关性, 而TC, Cr和Cu与真菌群落结构显著相关。本研究初步从整体水平上探究了不同浓度重金属对铅锌矿区真菌多样性的影响, 结果表明Pb 含量与微生物群落结构具有极显著相关性, 散囊菌目在铅锌矿区分布较为广泛, 对重金属的适应能力较强, 是矿区的最优势菌, 具有作为重金属污染土壤监测生物表征及污染防治的应用潜力。
The authors have declared that no competing interests exist.
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1 材料与方法
1.1 铅锌矿区土壤样品的采集
1.2 铅锌矿区土壤样品重金属含量测定
1.3 铅锌矿区土壤样品理化性质测定
1.4 矿区样品DNA提取
1.5 ITS高通量测序分析
2 结果与分析
2.1 样品土壤重金属含量
样品 编号 重金属含量/(μg · g-1) Cr Ni Cu Zn As Cd Hg Pb Cp5 HP1 71.5 95.9 92.7 21700 338.4 240.7 3.4 10560 Mc3 HP2 91.6 64.7 60.4 7001 192.6 70.1 1.0 3713 Mc1 HP3 91.8 68.6 63.4 8896 163.7 84.8 0.8 3818 Cp3 HP4 101.5 43.6 43.2 2398 67.9 19.8 0.8 1549 Es3 HP5 95.3 51.0 58.5 4176 35.1 114.3 0.8 530.3 Es4 LP1 88.1 41.6 42.9 1198 27.1 29.0 0.5 277.8 Nf5 LP2 102.7 59.3 65.0 604.3 36.2 1.5 0.7 134.3 Ra1 LP3 105.0 63.3 59.0 246.2 51.7 1.7 0.6 178.0 Sd4 LP4 69.6 40.1 33.4 150.6 23.3 1.4 0.6 72.0
2.2 铅锌矿区土壤样品理化性质
编号 TC/% TN/% 含量/(mg · kg-1) pH AP NH4+-N NO3--N HP1 4.31±0.38 0.35 ±0.01 20.17 ±1.10 17.80 ±2.53 1.37 ±0.52 7.50 ±0.00 HP2 3.84±0.16 0.18 ±0.01 10.24 ±0.41 17.20 ±0.55 0.81 ±0.15 7.37 ±0.06 HP3 3.32±0.21 0.21 ±0.01 6.18 ±0.68 50.89 ±1.79 2.66 ±0.12 7.50 ±0.10 HP4 3.80±0.39 0.20 ±0.01 15.31 ±0.03 2.85 ±0.29 127.71 ±9.26 6.80 ±0.00 HP5 3.58±0.21 0.22 ±0.00 15.98 ±1.75 11.58 ±0.99 1.07 ±0.40 6.83 ±0.06 LP1 1.85±0.52 0.16 ±0.00 7.59 ±2.88 10.33 ±1.55 0.84 ±0.18 6.40 ±0.00 LP2 0.36±0.14 0.11 ±0.00 0.06 ±0.49 3.15 ±0.70 6.46 ±0.69 6.10 ±0.00 LP3 4.20±0.38 0.17 ±0.01 15.09 ±0.17 13.00 ±2.35 0.78 ±0.14 7.23 ±0.06 LP4 1.78±0.55 0.13 ±0.00 16.62 ±1.40 4.22 ±0.92 16.87 ±0.39 7.40 ±0.00
2.3 ITS高通量测序结果
2.4 不同程度重金属污染土壤中的真菌群落结构
2.5 不同理化性质与微生物群落多样性影响研究
3 讨论与结论
参考文献
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