德兴铜矿是中国最大的露天开采矿区, 开采历史悠久, 对周边环境产生一定的影响, 也为研究特殊环境下的微生物分布特征提供了素材。大坞河源头低品位矿石堆浸场产生的酸性废水, 使河流上游受到严重污染, 中下游水质有所改善, 离河岸越远的土壤受污染河水的影响越小^[1]。微生物群落的分布受元素地球化学性质的影响, 且无法简化控制微生物群落结构的多种因素^[2]。淋滤作用会导致部分细菌菌群的突变^[3]。目前从德兴铜矿区筛选出的一些菌种对矿石具有淋滤或氧化作用, 如Acidiphi-lium sp. PJH^[4], Leptospirillum ferriphilum YTW315^[5], Acidiphilium cryptum DX1-1和Acidithiobacillus ferrooxidans GF^[6]。但有关德兴铜矿区周围土壤微生物的分布以及与重金属元素的相关性还未见报道。本文就德兴铜矿及其周围环境土壤的微生物分布特征展开研究, 并结合重金属元素的分布特点, 分析和探讨土壤纵向剖面微生物的分布与重金属元素的空间依存关系。

1 材料与方法 1.1 土壤样品

土壤样品分别采自江西上饶德兴铜矿区的祝家村(ZJC)和大坞河-沽口(DWH-GK)。祝家村和大坞河-沽口位于大坞河流域, 距矿区较近, 受矿区排出的酸性废水影响。利用土样采集器分别在每一个采样点采集3~4个土柱。由于各个地段的土壤湿度、疏松程度各不相同, 因此采集的土壤深度有所差异, 在41~45 cm之间。采集后的土柱用塑料膜包好、密封、避光保存, 使其保持原有状态, 并放入4℃冷藏箱, 迅速带回实验室, 转入4℃冰柜中保存备用。

从各采样点的土柱0, 10, 20, 30, 40 cm深度处各取约5 g土壤样品, 分别装入纸袋, 在烘箱中干燥后, 去除其中植物碎片、砾石等物质, 用玛瑙研钵磨细, 过200目尼龙网筛, 装入样品袋备用。

1.2 土壤样品的微生物纯培养

1.2.1 材料与仪器

LB培养基:蛋白胨10 g, 酵母粉5 g, NaCl 10 g, 葡萄糖3 g, 去离子水1 L, pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏2.5 g, 蛋白胨5 g, NaCl 5 g, 葡萄糖3 g, NaNO₃ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.01 g, NH₄Cl 1 g, KH₂PO₄ 2.7 g, K₂HPO₄ 2.7 g, 去离子水1 L, pH 7.0。

0.2 MPBS: NaH₂PO₄·2H₂O 1.217 g, Na₂HPO₄· 12H₂O 4.37 g, 去离子水100 mL, pH 7.0。

固定液: 50 mL PBS (0.2 mol/L pH 7.0)中加入1 g多聚甲醛, 于60℃水浴1小时溶解, 冷却后加入25 %戊二醛水溶液10 mL, 加水至100 mL。

HZQ-F100振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); 电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司); LRH-150生化培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

1.2.2 土壤微生物分离纯化

将前处理过的0~40 cm DWH-GK土壤样品取5 g加入到200 mL LB液体培养基中, 在30℃, 150 rpm条件下震荡培养2~3天, 见明显微生物生长后, 用平板划线法接种到相同培养基的培养皿中, 在30℃下培养。反复纯化, 最后挑出单一菌落在液体培养基中富集培养并测出基因序列。对ZJC土壤同样做此处理, 但接入200 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中。

1.2.3 扫描电镜观察微生物形态

菌液样品制样    配制足量0.2 mol/L PBS, 取部分稀释成0.1 mol/L PBS。用EP管收集培养了2~3天的菌液, 4000 rpm离心5分钟。用0.1 mol/L PBS颠倒混匀重悬细胞5分钟后, 以3000 rpm离心5分钟去除上清液, 重复2次。弃上清液后, 加入固定液, 温和混匀。室温下固定0.5~4小时。然后, 用PBS清洗2~3次, 进行乙醇梯度脱水, 每步以3000 rpm离心5分钟。完成后进行乙酸异戊酯置换, 同样每步需以3000 rpm离心5分钟。将离心浓缩后的菌液滴在硅片上, 用合适尺寸的普通定性滤纸包好, 放入临界点干燥器样品室, 进行CO₂临界点干燥。取出后用变色硅胶保存, 确保干燥。

固体培养样品制备    选择固体平板中长好的湿润菌落, 取其中生长适中的部分用无菌刀片切下, 放置在贴好石墨胶带的样品台上。

1.3 土壤微量元素的测定

1.3.1 样品预处理

准确称取待测土壤样品25 mg于洗净的Teflon溶样罐中, 用移液器缓慢加入1.5 mL浓HNO₃和1.5 mL浓HF, 盖上罐盖在电热板上70℃恒温过夜, 使样品慢慢与酸反应。第二天启盖, 在电热板恒温150℃条件下加热至湿盐状。

取下溶样罐, 其内加1.5 mL HF和1.5 mL的1:1 HNO₃, 加盖, 放入不锈钢套内, 旋紧钢套。将高压溶样罐放烘箱内, 在180℃恒温条件下保温72小时, 随时观察烘箱状态。冷却到室温后取出溶样罐, 开盖, 在150℃左右的恒温电热板上蒸发, 冒白烟, 至样品溶液呈湿盐状。

在溶样罐内加入3 mL的1:1 HNO₃, 加盖放入不锈钢套内, 再次放入烘箱内, 于150℃恒温条件下加热过夜。冷却到室温后取出, 再在恒温加热板上加热蒸发呈湿盐状(150℃)。在溶样罐内加入1 mL的1:1 HNO₃, 充分摇匀, 在电热板上加热片刻, 使其盐类溶解, 此时应呈清液状。

将溶液转入50 mL比色管内, 并多次用1%的HNO₃溶液(含10 ng/mL)冲洗溶样罐, 以确保样品溶液完全转移, 最后再用1% HNO₃(含10 ng/mL)冲洗到刻度, 充分摇匀。摇匀后立即转移到小塑料瓶中待测。

1.3.2 分析方法

用ICP-MS分析土壤的微量元素, 标液使用国家标准样品GSS-7。用Excel处理数据。

2 结果与讨论 2.1 土壤中的可培养微生物

从大坞河-沽口河岸和祝家村土壤样品分离和纯化出多种微生物菌株。根据在培养皿中的生长形态和颜色不同, 微生物菌株被分为13组。在大坞河-沽口河岸土壤剖面中, 40 cm层位有一种真菌; 在祝家村土壤剖面中, 20 cm层位分布有两种真菌, 30 cm层位出现3种真菌。细菌则在整个剖面都有分布。

对从大坞河-沽口河岸土壤样品分离的微生物菌株进行测序分析, 结果表明, 大坞河-沽口河岸土壤中共有5种细菌, 分别是球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。真菌有座囊菌纲煤炱目Davidiellaceae科。

对从祝家村土壤分离的微生物菌株做PCR分析, 结果表明, 祝家村土壤中有6种细菌, 分别是球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)。真菌有尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、橘青霉(Penicillium citrinum)和一种内生真菌。

2.2 微生物的基本特征

解淀粉芽孢杆菌:革兰氏阳性, 杆状, 短粗, 呈椭圆形, 两端钝圆; 可形成内生芽孢, 芽孢囊不膨大, 中生到次端生, 近圆柱状, 单个长度在1~2 μm之间(图 1(a))。平板培养呈白色或淡黄色不透明菌落, 表面粗糙微隆, 湿润, 边缘不规则, 无色素生成(图 2(a))。

蜡状芽孢杆菌:革兰氏阳性, 杆状, 大小为(1.0~1.3) μm×(3.0~5.0) μm, 末端方, 成短或长链, 有运动性; 芽孢圆形或柱形, 中生或近中生, 1.0~1.5 μm, 孢囊无明显膨大, 无荚膜(图 1(b))。平板培养菌落较大, 呈圆形或近圆形, 白色似蜡, 表面粗糙扁平, 不规则不透明, 无色素, 边缘呈扩展状(图 2(b))。

球形赖氨酸芽孢杆菌:长杆状, 革兰氏阳性, 末端圆, 有运动性, 长度2~6 μm, 多数长3~4 μm, 宽1 μm, 一端明显膨大, 还可观察到芽孢产出(图 1(c))。平板培养菌落为浅黄色, 圆形或椭圆形, 不透明, 表面光滑, 微隆起, 边缘齐整(图 2(c))。

假蕈状芽孢杆菌:短杆状, 两端圆, 椭圆状, 近球形, 个体较小, 长约1~2 μm (图 1(d)), 芽孢中生, 多成对或链状。平板培养菌落较小, 点状, 浅黄色到黄色, 不透明, 表面光滑, 微隆起, 边缘齐整, 中心略凹陷(图 2(d))。

棘孢木霉菌:菌丝密集(图 1(e)), 层厚适中, 呈平整毡状, 初期白色, 后期产生分生孢子, 呈黄色或黄绿色(图 2(e)); 孢子梗对生生长, 主分枝树状, 孢子梗长6.5~12.5 μm, 中间宽3~4.5 μm, 基部宽2~3.5 μm, 瓶梗短, 基部细, 中间膨大, 底部瓶梗较长, 节间较短, 分生孢子球形, 亚球形或卵形, 表面粗糙, 3.2~5 μm×2.5~4 μm。

尖孢镰刀菌:菌丝层厚适中, 白色棉絮状或绒毡状(图 2(f)); 菌丝致密饱满, 细长少分枝, 节间较长, 分生孢子小(图 1(f))。

2.3 构建系统发育树

将测定的DNA序列用Blast软件与Genbank中已知序列进行同源性比对, 并利用Clustal X及Mega 5.0对菌株进行发育分析, 绘制系统发育树(图 3和4)。

在分离得到的这些菌种中, 解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、棘孢木霉和尖孢镰刀菌的基因序列已上传到Genbank, 并获得序列号KJ188737-KJ188742。

2.4 土壤重金属元素的分布特征

对大坞河-沽口河岸和祝家村的土壤样品分别进行重金属元素分析。分析结果表明:在大坞河-沽口河岸土壤中(图 5), V的含量随土壤深度的增加变化不大; Mn的含量在深度0~20 cm的下降幅度不大, 在30 cm有所增加; 表层Co的含量较高, 且在10~40 cm, Co含量随深度的增加而增加; Ni含量从0~20 cm逐渐升高, 在20 cm处升高的幅度最大, 但紧接着在30 cm含量突降; Cu的含量相对较高, 但变化规律不明显; 除个别层位外, Pb含量总体表现为随着深度增加而降低的趋势。

祝家村土壤中(图 6), V的含量从0~10 cm降低, 而从10~40 cm缓慢升高; 表层Mn的含量比较高, 且在10~40 cm, 随深度增加, Mn的含量逐渐升高; Co的含量变化规律与大坞河-沽口河岸土壤相似, 表层较高, 10 cm以下, Co的含量随深度的增加而增加; Ni的含量变化无明显规律性; Cu的含量相对较高, 在20 cm处最高; Pb的含量变化不大, 且无规律性。

2.5 微生物在土壤纵向剖面的分布特征

大坞河-沽口河岸土壤和祝家村土壤的微生物种类有一定的相似性, 都存在球形赖氨酸芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和苏云金芽孢杆菌这3种细菌; 但真菌方面相似性不大, 没有相同的真菌出现。

在大坞河-沽口河岸土壤中(图 5), 球形赖氨酸芽孢杆菌除30 cm层位外均有分布; 铜绿假单胞菌需要氧气, 仅分布在0 cm; 苏云金芽孢杆菌在该地区对元素的耐受性好, 在0~40 cm层位都有分布; 蜡状芽孢杆菌与球形赖氨酸芽孢杆菌正好相反, 只出现在30 cm; 地衣芽孢杆菌喜近水生长, 只出现在40 cm层位, 可能与当地的地下水位有关。不少研究指出, 蜡状芽孢杆菌对Cd, Pb, Cr, Cu和Mn等重金属离子有积累、吸附作用, 在不同的环境下还分别有氧化和还原作用^[7-13]。有研究表明, 地衣芽孢杆菌为嗜热菌, 有吸附重金属离子、降解水体中污染物的作用, 其中Mn离子还可促进它生长和繁殖^[14-15]。

在祝家村土壤中(图 6), 球形赖氨酸芽孢杆菌对元素的变化不敏感, 遍布整个剖面。铜绿假单胞菌和假蕈状芽孢杆菌因其生长需要氧气, 仅出现在0 cm层位。苏云金芽孢杆菌出现在0, 10, 40 cm层位。解淀粉芽孢杆菌只出现在30 cm层位, 解淀粉芽孢杆菌能够降解有机物, 生成α-淀粉酶, Ca²⁺和Mg²⁺会促进α-淀粉酶的产生, 可能是因为该层位有相对较多的有机物积累^[16]。溶血葡萄球菌在20 cm和40 cm层位出现, 该菌株容易被Cu损伤^[17]; 40 cm处Cu含量较低, 有利于生存; 20 cm层位Cu含量虽高, 但可能存在有利于该菌株生长的其他因素。橘青霉出现在20 cm和30 cm层位, 该菌株可以产生一种核酸酶P1, 金属离子Zn²⁺, Sn²⁺和Mn²⁺能促进橘青霉的生长^[18]。在20 cm和30 cm层位, 重金属离子浓度相对偏低, 且Zn²⁺, Sn²⁺和Mn²⁺的浓度较适宜, 有利于橘青霉的生长。尖孢镰刀菌仅出现在20 cm层位, 可能是受到解淀粉芽孢杆菌的抗菌性影响^[19], 无法向下扩展。棘孢木霉出现在30 cm层位, 该菌能够抑制多种病原真菌的生长, 并降低土壤重金属元素对植物生长的抑制作用^[20]。同一层位所分离的真菌种类少, 可能与棘孢木霉有一定的关系。内生真菌分布在30 cm层位。

大坞河-沽口河岸土壤的微量元素分析结果表明, 大多数金属离子的含量从20 cm层位开始下降, 可能与蜡状芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的生长繁殖有关。其中, 蜡状芽孢杆菌可能在一定程度上减少了Cu和Pb在该层位的含量, 与Cu和Pb相反, Mn的含量上升, 或有其他因素干扰。

在祝家村土壤中, Cu元素影响和抑制溶血葡萄球菌的生长和代谢。Zn²⁺, Sn²⁺和Mn²⁺控制橘青霉的生长。解淀粉芽孢杆菌抑制尖孢镰刀菌的生长, 棘孢木霉抑制同层位的其他真菌的生长, 与重金属元素的分布关系尚不明确。

3 结论

本文以江西德兴铜矿及其周围环境土壤为研究对象, 分析和研究了土壤微生物的分布特征, 探讨土壤表层微生物与重金属的空间依存关系, 得出以下结论。

1) 从大坞河-沽口河岸和祝家村土壤中分离出可培养微生物13种, 其中从大坞河沽口河岸土壤中分离出5种细菌和1种真菌, 从祝家村土壤中分离出6种细菌和4种真菌。

2) 大坞河-沽口河岸和祝家村土壤中的细菌在种类和分布层位上具有一定的相似性, 有3种细菌在两处都存在。但在真菌方面, 大坞河-沽口河岸和祝家村土壤之间相似性不明显, 祝家村土壤可培养的真菌种类比较多。

3) 土壤剖面微生物的分布与重金属元素含量并非简单的线性关系, 还受到多种环境因素的影响。