图1 活性污泥聚磷表型的原位单细胞拉曼光谱指纹与种群功能异质性
Fig.1 In situ single-cell Raman spectral fingerprints and functional heterogeneity of Poly-P phenotypes in activated sludge
北京大学学报(自然科学版) 第62 卷 第4 期 2026 年7 月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 62, No. 4 (July 2026)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2026.039
国家自然科学基金(32570103)资助
收稿日期: 2026-01-20;
修回日期: 2026-04-30
In Situ Metabolic Diagnosis and Targeted Sorting of Polyphosphate-Accumulating Organisms in Activated Sludge Based on Single-Cell Raman Spectroscopy
水体富营养化是全球水环境治理面临的重要挑战, 而磷是引发该问题的关键限制性因子[1-2]。在现代城镇污水处理体系中, 强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal, EBPR)工艺凭借其经济性、低碳及环境友好的特质, 成为去除磷污染的主流方案[3-5]。该工艺的高效运行主要依赖于活性污泥中的聚磷菌(polyphosphate-accumulating organisms, PAOs)。PAOs 具备典型的超量吸磷(luxury uptake)代谢特征, 在厌氧条件下分解胞内多聚磷酸盐(polyphosphate, Poly-P), 释放正磷酸盐, 并储存碳源, 随后在好氧条件下利用胞内储碳产生的能量,过量地摄取污水中的溶解性正磷酸盐(soluble orthophosphate, SOP), 将其以 Poly-P 的形式储存于细胞内, 最终通过排放富磷剩余污泥, 实现磷素的去除[6-8]。因此, 活性污泥中聚磷菌群落的原位代谢活性与群体丰度直接决定生化系统的除磷效能。
尽管 EBPR 工艺在工程应用中已相对成熟[9],但在微观层面, 对聚磷菌进行精细化的监测与纯培养分离仍然面临技术瓶颈。一方面, 传统的理化监测指标(如总磷和混合液悬浮固体浓度等)反映群体的宏观均值[10], 无法在单细胞分辨率下捕捉微生物的实时生理状态。当系统出水水质发生波动时, 往往难以准确地界定其原因是有效生物量的流失, 还是单细胞层面的代谢活性受抑[11-14]。另一方面, 原位环境中的聚磷菌难以在实验室条件下进行分离和纯化, 因此纯培养菌株资源严重匮乏。虽然宏基因组学已揭示相关微生物具备除磷的基因潜力, 但并不等同于实际的原位功能表达[13-15]。实体菌株资源的缺失, 极大地限制对聚磷菌生理机制的深度解析与高效生物强化技术的开发。
单细胞拉曼光谱(single-cell Raman spectroscopy, SCRS)是一种免标记、无损的探测技术, 为微生态群落功能解析提供了有效的工具[16]。聚磷菌胞内的 Poly-P 在拉曼位移 1170 cm-1 处具有强烈的特征散射峰, 且信号强度与胞内 Poly-P 绝对含量显著正相关[10,14], 因此 SCRS 可作为定量评估单细胞聚磷活性的原位分析手段。进一步地, 结合微流控技术的拉曼激活细胞分选(Raman-activated cell sorting,RACS)系统实现基于代谢表型的靶向活细胞分离,有效地连接从原位表型诊断到实体菌株获取的技术流程[17-19]。
然而, 当前针对除磷微生态的拉曼研究多局限于定性识别[20], 尚未利用大规模原位单细胞光谱数据建立环境底物-单细胞表型的定量响应模型。依据 Monod 动力学原理, 好氧池中的实时 SOP 不仅是反应底物, 更是驱动聚磷菌进行聚磷代谢的关键诱导因子[21-22]。因此, 探明环境磷负荷波动对群落丰度扩增与个体代谢增强的协同调控机制, 对深入地理解和优化除磷工艺具有重要意义。
本研究以污水生化处理系统好氧池末端活性污泥为对象, 构建“原位诊断-靶向分选”一体化策略。1) 原位诊断: 通过采集 5 个具有 SOP 浓度梯度的稳态批次样本(获取逾 5 万条单细胞光谱数据),构建基于 Poly-P 表型的生态响应模型, 量化并解析聚磷菌代谢活性对环境 SOP 浓度的响应规律; 2) 方法确证: 建立基于人工模拟群落的方法学验证体系,证实 RACS 技术在复杂微生态样本中精准地识别与分离目标细胞的可靠性; 3) 靶向获取: 依据原位模型确定的高活性生物学阈值, 对富集培养后的混合污泥微生态实施靶向分选, 以期获得具备高聚磷潜能的纯培养聚磷菌株。
本研究旨在为污水脱磷系统的微观量化诊断提供理论支撑, 并为难培养功能微生物资源的定向挖掘提供精确的技术路径。
样品采集于青岛市某采用 A2O 工艺的污水处理厂。为了构建能够定量反映聚磷菌群代谢行为的环境因子-单细胞表型响应模型, 本研究依据 Monod酶促反应动力学中底物诱导机制(substrate-induced mechanism), 制定基于环境底物梯度的定向采样方案。在系统运行的典型稳态周期内, 通过实时水质追踪, 精准地锚定 5 个具有显著溶解性正磷酸盐浓度梯度的典型好氧池末端工况批次。经测定, 这 5个批次(Group 1～Group 5)的实时 SOP 浓度分别为0.10, 0.85, 0.64, 0.80 和 0.42 mg/L。采样点统一设于好氧池末端, 单次采集 200 mL 混合液, 随即置于4℃恒温冰盒中暂存与转运, 旨在通过低温, 迅速地抑制微生物的酶促生化反应, 最大限度地锁定并保留细胞在采样瞬间的原位多聚磷酸盐(Poly-P)含量水平。溶解性正磷酸盐浓度采用标准的钼锑抗分光光度法(GB 11893—89)测定, 测定工作与污水样本的细胞提取同步进行, 确保环境理化数据与单细胞表型数据的时空匹配性。
活性污泥中复杂的胞外聚合物(EPS)及无机矿物颗粒往往产生强烈的光谱背景噪声, 并且极易阻塞微流控芯片通道[23-24]。为此, 我们优化预处理流程, 利用差速离心法分离微生物细胞, 获取高纯度高分散性的单细胞悬液, 具体步骤如下。1) 取混合液样品 40 mL, 置于 50 mL 离心管中, 经 10000 r/min离心 5 分钟, 去除上清, 加入分离缓冲液(0.85 g Nacl加 500 uL 吐温 20, 超纯水定容至 1 L), 搅拌并用 5档涡旋振荡 30 分钟。2) 配平后, 1500 r/min 离心 15分钟, 去除大颗粒无机泥沙及絮体, 用移液枪缓慢地吸取含菌上清液于新的 50 mL 离心管中, 10000 r/ min 离心 5 分钟, 若离心后仍然明显地观察到沉淀物含大量杂质, 则重复一次上述步骤。3) 将收集的菌体沉淀转移至2 mL 离心管中, 使用无菌去离子水10000 r/min 离心洗涤 3 次, 彻底去除溶液残留及背景磷酸盐。
在应用拉曼激活细胞系统处理复杂环境样本前, 建立基于已知表型的准确率验证体系至关重要。本研究构建一个包含“1 株阳性菌+3 株阴性菌”的人工模拟微生物群落(mock community), 利用各菌株在固体平板上显著的颜色表型差异, 实现分选准确率的可视化评估。群落构建与参数设定如下:阳性对照选取本实验室保藏的 Strain 5-8 (具有强Poly-P 拉曼峰, 菌落呈淡黄色); 阴性干扰组则由大肠杆菌(E. coli, 白色)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B. cepacia, 鲜黄色)和巨大芽孢杆菌(B. megaterium, 乳白色)组成。4 株菌经活化后, 按等浓度混合(阳性菌的理论占比为 25%)。依托青岛星赛生物科技有限公司提供的单细胞分析分选技术平台进行实验, 设定 532 nm 激发光(100 mW, 1 s)获取信号, 利用 1064 nm 光镊结合介电泳力场(DEP, 强度 107)实现捕获。以 1170 cm-1 峰强度为门控信号, 设置 3 个平行分选组、1 个阳性对照组(混合菌液稀释涂布)及两个阴性对照组。阴性对照组 1 为系统空白对照, 分选时仅通入分选缓冲液并收集涂布, 用于验证微流控芯片及管路无污染; 阴性对照组 2 为非触发门控对照, 通入人工模拟群落样本, 但不进行光镊捕获,用于排除非特异性污染, 即在介电力聚焦作用下,非目标细胞可以隔离在主通道中而不进入收集口。
针对采集的 5 个梯度批次样本, 保持与验证实验一致的仪器参数, 累计获取逾 50000 条单细胞原位拉曼光谱, 构建活性污泥单细胞代谢指纹数据集。为实现高通量单细胞光谱数据的可重复处理与统计建模, 本研究在 R(v4.5.1)环境下建立标准化数据分析流程, 包括光谱质量控制与预处理、批次间样本量均一化以及智能阈值扫描建模 3 个步骤。
1.4.1 质量控制与预处理
构建基于信噪比(SNR)的自动化过滤算法, 将苯丙氨酸峰(1003 cm-1)作为生物信号基准, 剔除SNR＜3.0 的低质图谱[25]。本研究选取 1003 cm-1 处的苯丙氨酸特征峰作为表征单细胞生物体积与干重的内标参量。如图1(a)中叠加光谱所示, 该特征峰在面临不同 SOP 浓度波动的群体光谱中均表现出极佳的峰值一致性与稳定性, 是理想的内参基准。采用非对称最小二乘法(AsLS)扣除荧光背景后, 计算 Poly-P 特征峰与苯丙氨酸内标峰的相对强度比(Ratio=I1170/I1003)。通过该比值, 不仅实现聚磷代谢活性的半定量化, 还有效消除因细胞体积大小不同或光学焦平面微小偏移引发的绝对信号强度测量误差。
图1 活性污泥聚磷表型的原位单细胞拉曼光谱指纹与种群功能异质性
Fig.1 In situ single-cell Raman spectral fingerprints and functional heterogeneity of Poly-P phenotypes in activated sludge
1.4.2 样本量均一化
为了消除不同批次间由于拉曼光谱采集数据量不一致带来的统计偏差, 本文基于各批次中的最小样本量, 对所有组别的数据进行随机重抽样均一化处理。
1.4.3 智能阈值扫描建模
为量化和解析环境磷负荷波动对微生物群落响应的驱动关系, 本研究构建了基于大数据的环境底物因子(SOP 浓度)与单细胞代谢表型(Poly-P 拉曼特征)统计学关联模型。核心算法是在单细胞 Poly-P活性指数(Ratio)为 0.1～15 的数值范围内, 以微小的步长滑动, 设定活性判别阈值(Cutoff)。随后, 遍历计算每一给定阈值下划分出的高活性细胞亚群的相对丰度及其单细胞平均拉曼强度, 并分别评估这两项核心指标与实时环境 SOP 浓度之间的 Pearson 相关系数。最终, 依据模型拟合优度(R2)最大化原则, 确定用于判别高效聚磷菌的最佳生物学阈值。
基于原位诊断模型确定的高活性阈值, 我们将研究工作从表型观测推进到活体纯培养菌种的资源挖掘。为最大化地激发目标微生物的超量聚磷表型, 在进行拉曼分选前对活性污泥进行短期强化诱导, 即制备完成的活性污泥单细胞悬液经离心洗涤后, 重悬于人工配制的富磷培养基(成分: 3.23 g 三水合乙酸钠, 0.025 g 磷酸二氢钾, 0.3056 g 氯化铵, 0.046 g 硫酸镁, 0.0256 g 二水合氯化钙以及 2 mL 微量元素溶液; 溶液中加入 8.5 g PIPES(预先使用 1 mol/L NaOH 溶解)作为缓冲剂, 最终定容至 1 L, 并将 pH 值调节至 7.0)中, 在 200 rpm 好氧振荡条件下进行 12 小时的诱导。诱导结束后, 对样本进行离心, 收集菌体, 并用无菌去离子水 10000 r/min 离心洗涤 3 次。收集清洗后的菌体沉淀于 2 mL 离心管中, 加入 1%的 PF127, 防止细胞在微流控通道内的非特异性吸附。最后, 通过血球计数板(Neubauer型, 普兰德(上海)贸易有限公司)计算样品浓度, 并将其稀释至 105 cfu/mL, 获得高分散度的单细胞悬液, 满足上机浓度需求。利用拉曼激活细胞分选技术, 对样本实施靶向捕获。将被光镊精准捕获的高Poly-P 表型单细胞被封装于微液滴中, 直接涂布至LB 平板培养。针对长出的单克隆菌落, 采用通用引物(27F/1492R)扩增 16S rRNA 基因全长序列, 经测序及 NCBI BLAST 比对, 确定其分类学地位, 完成从光谱表型预测到实体菌株获取的方法流程。
为揭示活性污泥微生物群落对环境磷负荷的原位响应机制, 本研究首先对 5 个处于不同稳定状态(SOP 浓度: 0.1～0.85 mg/L)的好氧池污泥样本进行大规模单细胞拉曼光谱采集(每个样本 n＞50000)。如平均光谱叠加图(图1(a))所示, 好氧末端微生物细胞在 1003 cm-1处均呈现显著的苯丙氨酸特征峰, 表明细胞群体整体保持活跃的蛋白质合成与良好的生理状态。更重要的是, 1170 cm-1 处的无机多聚磷酸盐特征峰在所有批次中均被检测到, 但相对强度存在明显的波动。上述结果初步表明, 微生物群落的代谢活性并非恒定不变, 而是随着环境磷浓度的变化而动态地调节。
然而, 群体平均光谱可能掩盖单细胞水平的异质性。为此, 我们在单细胞尺度上计算Poly-P 活性指数(Ratio), 并绘制其对数分布图谱。图1(b)显示聚磷群落具有高度的功能异质性, 并呈现明显的金字塔式功能分层结构。
非活性基质(Ratio＜0.41): 红色水平虚线以下聚集大量 Poly-P 信号极弱的细胞, 主要包括非聚磷功能的普通异养菌及糖原累积菌[9], 它们构成系统生物量基础, 但不主导除磷过程。
基础 PAOs 亚群(0.41＜Ratio＜2.54): 该区间分布数量众多的中低活性聚磷菌, 分布密度在不同环境批次中差异显著, 提示该类菌群处于生理临界状态,易因环境底物浓度波动的影响而发生代谢状态的切换。
高活性 PAOs 亚群(Ratio＞2.54): 分布图谱顶端的长尾区域存在 5%～15%的高效聚磷单细胞, 其单细胞 Poly-P 储备量极高。这一发现补充了传统上依赖宏观理化指标(如混合液悬浮固体浓度和系统总除磷率等)将污泥群落视为代谢功能均一整体的局限[10,13]。原位单细胞光谱数据直观地揭示, 真实的脱磷体系实际上是由大量基础代谢状态的 PAOs 和极少数高活性 PAOs 共同维系的复杂微生态网络。
通过引入智能阈值扫描算法, 本研究揭示出在具有显著功能分层的聚磷菌群落中, 环境磷负荷变化驱动其响应的具体机制, 即基于底物诱导的双重生态响应机制(图2)。
图2 基于底物诱导机制的活性污泥磷代谢原位诊断模型
Fig.2 In situ diagnostic models of phosphorus metabolism based on the “Substrate-Induced Mechanism”
机制 1: 低阈值下的活跃占比扩增(群体丰度响应)。将活性判别阈值设定为较低值 0.42 (即基础聚磷菌亚群的代谢门槛)时, 突破该阈值活性细胞的相对丰度与水体实时 SOP 浓度之间呈现极显著的正相关关系(R2 = 0.998, P ＜ 0.01)。这表明, 环境磷浓度的提升触发群落层面的活性细胞比例扩张, 较强的底物传质推动力促使大量原本处于休眠或微量吸磷状态的边缘细胞跨越基础代谢门槛, 转变为可观测的活性表型。这种策略本质上是一种相对比例依赖型响应(proportion-dependent response), 微生物微生态系统通过提升处于代谢活跃状态细胞的相对比例, 灵活地应对更加丰富的底物环境。
机制 2: 高阈值下的单体代谢潜能释放(单细胞活性响应)。当聚焦于 Ratio ＞ 2.6 的高活性聚磷菌亚群时, 生态响应呈现另一维度的数据关联。环境磷负荷的增加不仅导致该亚群在群落中的相对比例上升, 更显著地驱动单细胞平均 Poly-P 储备绝对强度的提升(R2= 0.996, P ＜ 0.01)。这意味着, 高浓度的底物不仅激活更多处于基础代谢的细胞, 而且进一步激发核心优势菌群个体的代谢潜能释放, 使其胞内Poly-P 积累量突破常规的基础生理水平。
综上所述, 结合横向稳态批次的单细胞光谱数据, 活性污泥微生态系统应对环境底物波动的策略,表现为一种群体活跃占比扩增与核心单体代谢潜能释放的双重协同响应机制。实验证实, 这两个维度的响应并非在不同磷负荷下独立发生, 而是随环境底物浓度的提升同步进行。系统在驱动活跃群体比例扩张的同时, 也提高了高活性功能单体的聚磷绝对强度。这一协同机制的阐明为后续纯培养功能菌种质资源的挖掘提供了明确的方向, 尽管低阈值的群体比例响应能灵敏地指示系统整体除磷状态的变化, 但若要通过筛选获得具备高工程应用潜力的优良种质资源, 必须重点识别并分选 Ratio ＞ 2.6 的高活性表型亚群。
将所建立的原位诊断模型应用于实际菌株挖掘前, 必须首先检验单细胞分选技术在复杂微生物体系中的准确性。为此, 我们采用人工构建的模拟微生物群落进行严格的验证。
图3 显示, 将以 Poly-P 特征峰作为门控信号的条件下, 3 个独立平行批次的分选产物均在平板上形成形态均一的淡黄色菌落, 表面湿润光滑, 形态特征与阳性对照菌株完全一致。统计结果表明, 系统有效屏蔽了背景中约 75%的阴性菌(表现为白色或鲜黄色菌落), 实现对聚磷表型细胞的极高分选准确率。同时, 阴性对照组(未触发分选信号)的零生长结果, 有力地证实微流控芯片流路具有极佳的清洗效率及光镊捕获特异性, 为后续挖掘功能单细胞奠定了坚实的方法学基础。
图3 基于人工模拟微生物群落的拉曼激活细胞分选准确率验证
Fig.3 Validation of accuracy in Raman-activated cell sorting based on synthetic microbial communities
基于前述揭示的底物诱导机制, 我们构建一条从原位表型诊断到靶向单细胞获取的技术路径。获取具有重要生态功能但难以用常规方法分离的微生物, 是一项极具价值的微生物种质资源(germplasm resources)挖掘工作。由于原位污泥中高活性 PAOs的自然丰度较低, 在分选前采用富磷培养基对污泥进行短期强化诱导。在随后的拉曼激活细胞分选过程中, 被光镊捕获的目标单细胞均展现极强的 1170 cm-1 Poly-P 特征拉曼峰(图4)。鉴于单细胞拉曼光谱能够对胞内 Poly-P 含量进行无损定量表征, 这种在分选瞬间实时获取的高通量光谱数据, 本身即构成所捕获细胞具备高聚磷活性的直接物理化学表型证据。
图4 拉曼激活细胞分选过程中的实时单细胞拉曼光谱
Fig.4 Real-time single-cell Raman spectra during Raman-activated cell sorting
通过单细胞微液滴分选与后续纯化扩增, 本研究成功构建一个包含 15 株单克隆菌株的功能微生物种质资源库(表1)。
表1 筛选菌株的分类鉴定及其生态功能特征
Table1 Taxonomic identification and ecological characteristics of the screened strains
菌株编号 鉴定菌名 数量 门分类 生态功能与文献依据S-01 Microvirgula aerodenitrificans 1 Proteobacteria 新型DPAO (key DPAO): 同时进行反硝化和除磷[26-27]S-02～S-09 Pseudomonas protegens 8 Proteobacteria 氧优势区兼快性速吸PA收O磷 (d[2o8m-29in]ant facultative PAO): 拥有ppk基因; 在好S-10 Acinetobacter pittii (DSM 21653) 1 Proteobacteria 经典聚磷菌(classic PAO): 与EBPR相关, 高超量吸磷能力[30]S-11～S-15 Acinetobacter baumannii 5 Proteobacteria 条件性聚磷菌(putative PAO): 在富磷条件下超量吸磷[31]
将分选时的强 Poly-P 拉曼信号与 16S rRNA基因鉴定结果及文献进行比对, 这 15 株纯培养物均属于 γ-变形菌纲, 可分为以下 3 类。
1) 反硝化聚磷菌: 成功分离出一株 Microvirgula aerodenitrificans。该菌为具有重要生态与工程意义的反硝化聚磷菌, 可在缺氧条件下以硝酸盐为电子受体, 同时完成脱氮与吸磷过程[26-27]。在传统好氧分选策略下, 此类“一碳双用”型 DPAO 易被遗漏,而基于 Poly-P 信号直接捕获的拉曼分选技术则能够实现对其进行有效的靶向挖掘。
2) 优势兼性聚磷菌: 资源库中丰度最高的菌株为 Pseudomonas protegens。假单胞菌属是已知的代谢通用型细菌[28-29], 在本研究中的高检出率表明,在富集-分选的强筛选压力下, 生长迅速且具备强大底物适应性的“机会主义”功能菌更容易占据生态位优势。
3) 经典“条件性”聚磷菌: 经过分选, 同时获得Acinetobacter pittii 与 Acinetobacter baumannii。尽管不动杆菌作为早期定义的“模式聚磷菌”, 其原位功能地位存在争议[30-32], 但本研究获得的单细胞光谱证据直接表明, 在特定高磷诱导条件下, 该类菌株表现出极强的 Poly-P 合成能力, 提示其在相应工艺条件下可能仍然是磷去除的重要贡献者。
综上所述, 结合单细胞拉曼表型与基因测序鉴定, 本研究在无需传统宏观盲筛的前提下, 成功地靶向获取 15 株具备极高聚磷潜能的纯种菌株。但是, 单细胞层面的超量储磷表型在扩大培养后能否在宏观反应器中持续发挥高效的除磷性能, 仍然需要在未来的研究中通过构建小规模 SBR 动力学实验来做进一步的评估。
本研究针对活性污泥除磷系统中单细胞代谢状态难以量化表征与关键功能菌株难以分离的问题, 构建融合单细胞拉曼光谱(SCRS)与拉曼激活细胞分选(RACS)的“原位诊断-靶向分选”一体化方法, 得出以下主要结论。
1) 方法学确证: 利用人工模拟微生物群落证实, 基于单细胞拉曼 Poly-P 特征峰的识别与光镊分 选技术, 能够在复杂微生物样本中精准地定位并分离目标高活性细胞, 展现出极高的分选准确率, 确立了将非侵入式细胞分选作为靶向获取环境功能微生物工具的可靠性。
2) 生态响应机制解析: 基于大规模原位单细胞光谱构建的定量诊断模型表明, 聚磷菌群落通过数量调控与活性调控的双重机制响应环境底物波动。环境溶解性正磷酸盐(SOP)浓度的升高不仅能够激活更多休眠或低活性细胞来扩大参与代谢的群体基数, 同时显著地提升核心高活性单体的胞内聚磷绝对强度, 两者协同, 动态地调控系统的除磷效能。
3) 靶向获取功能菌株: 依据原位诊断模型确定的高活性阈值(Ratio＞2.6), 对混合污泥实施靶向分选, 成功地分离并培养 15 株具备高聚磷活性的纯培养聚磷菌。经鉴定, 涵盖新型反硝化聚磷菌(Microvirgula aerodenitrificans)、优势兼性聚磷菌(Pseudomonas protegens)以及经典聚磷菌(Acinetobacter spp.)。该“原位表型诊断-靶向分选-纯种获取”技术路线为复杂微生态中未培养核心微生物的定向挖掘提供了精准可行的技术支撑。
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