图1 灞河采样点位置
Fig.1 Distribution map of sampling sites along the Bahe River
北京大学学报(自然科学版) 第62 卷 第4 期 2026 年7 月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 62, No. 4 (July 2026)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2026.046
国家自然科学基金(52209078, U2243201)、西安市青年人才托举计划(0959202513029)和中央高校基本科研业务费专项资金(xtr052025034)资助
收稿日期: 2025-04-25;
修回日期: 2025-05-26
Metagenomic Analysis Revealing the Community Structure and Nitrogen Metabolic Function of Eukaryotic Microbes Along the Bahe River
河流是生物多样性丰富的淡水生态系统, 参与全球水循环和生物地球化学循环, 为人类提供饮用水供应、农业灌溉、工业用水、休闲娱乐以及水电能源等重要服务[1-2]。河流中微生物活跃, 对维持水生态系统的稳定与功能至关重要[3]。近年来, 随着工业化进程的加速与城市化水平的不断提升, 城市河流不断地遭受日益加剧的人为干扰[4], 严重地影响河流的微生物群落、水资源健康以及生态系统功能。
真核微生物种类丰富, 形态各异, 是生物群落的重要组成部分, 在河流生物地球化学循环中发挥重要作用[5-6]。真核微生物包括一大类单细胞或多细胞微生物, 在水生食物网中扮演重要角色, 积极参与有机物分解、营养盐循环以及能量传递过程[7-8]。真核微生物能够通过多种途径进行氮代谢, 包括硝化作用、反硝化作用、亚硝酸盐还原和同化硝酸盐还原等[9]。在湖泊沉积物中, 真核微生物参与异化硝酸盐还原和完全硝化等氮代谢途径[10], 还能通过储存硝酸盐或亚硝酸盐来应对缺氧环境, 从而维持能量代谢[11-12]。
传统的微生物研究方法具有局限性, 很难展现群落结构的复杂性与多样性[13-14]。伴随着分子生物学技术的快速发展, 宏基因组测序技术无需培养, 能直接提取环境样本的 DNA, 可以全面认识群落结构, 剖析代谢功能, 并评估环境影响[15-16]。因此, 基于宏基因组学技术, 深入地探究城市河流中真核微生物及其氮代谢功能, 有助于揭示微观生态进 程[17-18], 同时为河流水质监测、生态风险评估和管理策略的制定提供科学依据。
灞河是典型的城市河流, 为西安市城市用水提供重要保障, 同时承受着城市化推进过程中的污染物排放及人类活动带来的压力。因此, 本研究选择灞河作为研究对象, 运用宏基因组技术, 系统地剖析灞河自上游至下游真核微生物群落结构及氮代谢功能特征, 以期为城市河流水质管理和生态保护提供科学参考。
灞河是黄河支流渭河的第二大支流, 流域面积约为 2581 km2, 是陕西省西安市的主要水源之一,对农业、工业以及饮用水的供应意义重大。随着城市化加速, 灞河流域水质不断恶化[19-20]。本研究在2023 年 3 月进行采样(采样前没有降雨), 根据河岸状况、水流情况以及河流长度, 设置 15 个采样点(图1), 其中上游山区河段(人类活动较少)设置 5 个样点(S1～S5), 中游农村地区河段(人类活动中等)设置 5 个样点(S6～S10), 下游城市地区河段(人类活动较多)设置 5 个样点(S11～S15)。根据国家标准(HJ/T 91—2002 和 HJ 494—2009), 用聚甲基丙烯酸甲酯水样采集器在水下 0.5 m 处采集 3 次水样, 混合成一份样品。24 小时内经 0.22 μm 聚碳酸酯膜过滤水样,滤膜用干冰冷却, 并即刻送实验室, 在-80℃ 下保存, 用于提取 DNA。同时, 收集约 1 L 的混合水样,储存在 0～4℃, 用于理化分析。
图1 灞河采样点位置
Fig.1 Distribution map of sampling sites along the Bahe River
对每个水样进行物理化学分析, 且重复 3 次。现场使用便携式水质分析仪(HK-258, 北京华科仪科技有限公司, 中国)测量水温(WT)、pH 值、电导率(COND)、总悬浮固体(TSS)、溶解氧(DO)和盐度(Salinity)。根据《地表水环境质量标准》(GB 3838 —2002)中推荐的方法, 使用紫外-可见分光光度计测量水样中叶绿素 a (Chl a)、硝酸盐氮(NO3--N)、铵氮(NH4+-N)和总磷(TP)的浓度。使用元素分析仪(Vario MAX cube, Elementar Analysensysteme GmbH, 德国), 测量可溶性有机碳(DOC)和总氮(TN)。采样过程中, 运用全球定位系统(GPS)记录每个站点的经度和纬度。
使用 FastDNA 试剂盒(MP Biomedical, CA, 美国), 按照标准操作程序, 提取两张滤膜样本的环境DNA, 混合后, 经质量检测合格, 使用 Illumina Novaseq 6000 平台测序, 每个样本原始数据量不少于30 Gbp。测序数据用 MEGAHIT v1.2.7 [21]拼接, 用EukRep v0.6.7 [22]检索最小长度为 2000 bp 的真核序列, 之后用 CAT v5.2.3 [23]的 contigs 模块比对 NR数据库, 进行物种注释。真核序列的蛋白质编码基因用 MetaEuk v4.a0 f584 d[24]及其提供的数据库进行easy-predict 模块预测, 使用 EggNOG-mapper v2.1. 11[25]进行功能注释, 参数设置为--seed_ortholog_ evalue 0.00001 -m diamond。使用 coverM v0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM)计算丰度, 用每百万映射读数的每千碱基读数(RPKM)表示, 阈值为 95%的同一性和 90%的覆盖率。
使用 R v4.3.1[26]进行数据分析处理和结果可视化, 基于 vegan 包计算并评估真核微生物的 α 多样性指数在不同分组间的差异, 相关图形可视化通过ggplot2 包完成。基于 Bray-Curtis 距离, 采用非度量多维标度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)和主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)来可视化群落结构, 并进行相似性分析(analysis of similarity, ANOSIM), PCoA 的置信区间设为 0.95。采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)和Mantel分析评估环境因子与真核微生物或氮代谢基因之间的相关性, Mantel 检验采用 Person 相关系数计算,并使用 ggcor 进行绘图。Spearman 相关性分析用于识别环境因子与氮代谢类群之间的响应关系, 采用LinkET 包进行可视化。
为了揭示灞河上中下游水环境特征差异, 本研究对各理化因子进行分析, 结果如图2 所示。WT与 NH4+-N 浓度呈现显著的下游富集特征, 下游的NH4+-N 浓度为 0.039±0.011 mg/L, WT 达到 14.54±1.49℃, 显著高于中游(WT: 11.58±1.35℃; NH4+-N:0.015±0.008 mg/L)和上游(WT: 9.92±2.65℃; NH4+-N:0.012±0.009 mg/L)。TP 浓度在下游(0.077±0.016 mg/L)和中游(0.058±0.018 mg/L)显著高于上游(0.029±0.009 mg/L)。Chl a 浓度在下游(22.22±5.06 μg/L)显著高于上游(11.12±5.76 μg/L)。COND 浓度则呈现中游(364.60±68.86 μS/cm)显著高于上游(246.80±19.44 μS/cm)的趋势。TN, NO3--N, DOC, TSS, pH 和 DO 在 3 个河段间无显著差异。
图2 物理化学变量的分布
Fig.2 Distribution of physiochemical variables
本研究共识别出 391 种灞河真核微生物, 涵盖38 门 98 纲 197 目 271 科 350 属(图3)。硅藻门(Bacillariophyta)在所有样点中的相对丰度最高(48.3%), 并且下游河段相对丰度显著增加(62.80%), 表明硅藻门在河流真核生物中占据主导地位, 其中圆筛藻纲(Coscinodiscophyceae)是主要贡献者。这种现象与下游水体中营养物质的富集密切相关, 充足的氮磷等营养元素为硅藻门(尤其是圆筛藻纲)的大量繁殖提供了有利条件[27-28]。节肢动物门(Arthropoda)在上游和中游相对丰度较高, 而在下游相对减少,与过往研究结果[29-30]类似。绿藻门(Chlorophyta)在上游相对丰度较高(52.76%), 其中绿藻纲(Chlorophyceae)在上游贡献较大, 特别是样点 S1, 主要因为上游水体相对清洁, 适合绿藻纲的生长[31-32]。子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)分布广泛, 但相对丰度较低, 子囊菌门在中游相对较高, 而担子菌门在上游相对较高。纤毛亚门(Ciliophora)在中游的相对丰度显著高于上游和下游, 其中旋毛纲(Spirotrichea)在中游的 S8 和 S10 等样点丰度较高, 可能因为中游河段具有适中的营养盐和有机物浓度, 为异养性纤毛虫提供丰富的食物资源, 促进其繁殖, 同时避免了高营养水平带来的竞争加剧或环境恶化等潜在负面影响[33-34]。上述研究结果表明, 真核微生物群落组成差异与环境变化之间存在紧密的响应关系, 有助于深入探究真核微生物在河流生态系统中的作用。
图3 真核微生物在门水平和纲水平的物种组成
Fig.3 Taxonomic composition of eukaryotic microbes at the phylum and class levels
首先探究灞河真核微生物在上、中、下游 3 个河段的 α 多样性特征(图4(a))。借助 Fisher’s LSD (最小显著差异)算法开展多重比较, 发现中游和下游的真核微生物物种丰富度以及 Simpson 指数均显著高于上游(p＜0.05), 表明中游和下游的真核微生物群落物种更多且结构更复杂, 与之前的报道[35]类似。下游的 Shannon 指数和 Pielou 均匀度指数显著高于中游(p＜0.05), 其次为上游。下游真核微生物群落不但物种多样性最高, 而且物种分布更均匀,表明下游水体具备较高的生态稳定性和功能多样性, 与亚热带海湾沉积物[36]和渤海-黄海[36]中真核微生物的分布规律一致。上游的真核微生物 α 多样性偏低, 可能因水体清澈、营养匮乏限制了群落多样性, 而中游和下游多样性显著提高, 或许与水体有机物含量及环境异质性有关。
图4 灞河真核微生物物种多样性(α 多样性分析(a), 非度量多维标度(NMDS) (b)及主坐标分析(PCoA) (c))
Fig.4 Diversity of eukaryotic microbial communities in the Bahe River (α diversity analysis (a), non-metric multidimensional scaling (NMDS) (b) and principal coordinate analysis (PCoA) (c))
进一步探究灞河不同河段真核微生物群落的 β多样性差异, 基于 Bray-Curtis 距离进行非度量多维尺度分析(NMDS, 图4(b))、主坐标分析(PCoA, 图4(c))及相似性分析(PERMANOVA, 图4(b))。PCoA结果显示, PCoA1 和 PCoA2 可分别解释总变异的38.49%和 24.37%, 表明不同河段的微生物群落结构有着显著的空间差异; NMDS 分析及 PERMANOVA 分析(R2 = 0.6)进一步验证了上述结果。灞河上、中、下游的真核微生物群落结构显著不同, 或许与河流自上游到下游不断增加的人为干扰以及水环境特征变化(如污染物输入和土地利用变化等)紧密相 关[20,37-38]。
通过 KEGG 对真核生物进行功能注释, 分析不同河段氮代谢基因的分布特征(图5(a))。结果表明, 在上游河段, 谷氨酰胺合成酶基因(glnA_GLUL)在所有氮代谢基因中相对丰度最高, 达到 81.6%, 其中 S4 和 S5 两个样点分别为 91.8%和92.3%, 远超其他功能基因, 表明该区域真核微生物主导氮同化代 谢。谷氨酸脱氢酶基因(GLUD1_2_gdhA)在上游部分样点同样呈现较高的丰度, 这种情况或许与氨同化过程紧密相关[39]。在中游河段, 氮同化过程仍然占据优势地位, 硝酸盐转运蛋白基因(NRT2_narK_nrtP_nasA)的相对丰度大幅度增加(p＜0.01), 从上游的 0.1%～0.3%升至中游的 3.5%～4.2%, 显示中游河段的硝酸盐吸收过程增强。下游河段的硝酸盐还原酶基因(NR)、硝酸还原酶基因(napA)和亚硝酸还原酶基因(nirA)等反硝化相关基因的相对丰度显著增加, 说明反硝化作用占据主导地位[39-40]。上述研究结果表明, 灞河真核微生物氮代谢功能从上游的同化作用主导转变为下游的反硝化作用占据优势。在上游河段, 由于人类干扰较少, 水质相对清洁, 氮素浓度较低, 微生物倾向于通过同化途径将氮元素固定为细胞生长所需的有机氮, 表现为同化作用的主导地位。随着城市生活污水和农业径流等人类活动的影响, 氮素负荷显著升高, 高浓度的硝酸盐和铵氮提供了反硝化过程的底物基础, 从而驱动反硝化基因的表达显著增强[41]。
图5 氮代谢功能基因的分布特征(a)及其对应物种分类(b)
Fig.5 Distribution (a) and taxonomic classification (b) of nitrogen metabolism genes
基于各个样点的代谢功能基因丰度数据, 进一步分析氮代谢功能基因与真核物种(门水平)的关联特征。结果显示, 绿藻门和硅藻门在氮代谢过程中占据主导地位(图5(b))。具体而言, 绿藻门贡献90.1%的谷氨酰胺合成酶基因(glnA_GLUL), 表明绿藻门在氮同化过程中占据绝对主导地位[42-43], 绿藻类通常对无机氮有较强的摄取和转化能力, 且其谷氨酰胺合成酶通路在淡水富营养环境中高效运行,可将氨快速地转化为谷氨酰胺等氮代谢中间产物,维持细胞生长[44-45]。在硝酸盐转运过程中, 硅藻门提供 86.4%的硝酸盐转运蛋白基因(NRT2_narK_nrtP_nasA), 且硅藻完全主导氨基甲酰磷酸合成酶基因(CPS1)、谷氨酸脱氢酶基因(GDH2; E1.4.1.4_gdhA)及谷氨酸合酶小亚基因(gltD), 表明硅藻门在氮固定和氧化还原反应中的重要生态功能, 尤其是在尿素循环过程中[46], 且相较于其他浮游植物, 硅藻对硝酸盐的偏好性更强, 在氮素受限的条件下,硅藻倾向于利用硝酸盐而非铵氮[47]。
响因素分析
RDA 分析结果表明, TP, NH4+-N 和 NO3--N是影响真核微生物群落变化的重要因素(图6(a)), 这些理化因子可以调控微生物营养代谢, 驱动生态位分化及资源竞争, 触发群落适应性演替及功能耦合,进而影响真核微生物的群落结构[48]。Mantel 相关性分析表明, 氮代谢基因与 NH4+-N, NO3--N, Chl a, COND 和 Salinity 均呈现显著的正相关关系(p＜0.05) (图6(b))。NH4+-N 和 NO3--N 作为氮代谢的核心底物, 可直接调控相关基因的分布变化[49]。COND 与Salinity 常协同变化, 共同调节胞外渗透压和平衡细胞内离子浓度, 间接地影响氮素的转运与代谢过 程[50]。高水平的 Chl a 可能伴随有机氮释放的增加, 进而刺激异养微生物的氮同化基因表达[51]。
图6 环境因素对真核微生物群落(a)、氮代谢基因(b)和参与氮代谢的真核微生物(c)的影响
Fig.6 Effects of environmental factors on eukaryotic microbial communities (a), nitrogen metabolism genes (b) and the eukaryotic microbes involved in nitrogen metabolism (c)
进一步对理化因子与参与氮代谢的真核微生物进行 Spearman 相关性分析, 结果如图6(c)所示。子囊菌门与 DO 显著正相关(p＜0.01), 子囊菌门包含多种好氧真菌, 其有机物分解和氨氧化过程都需要依赖氧气, 高 DO 环境可能会促进其呼吸作用和氮同化功能[52]。绿藻门与 COND 和 Salinity 显著正相关(p＜0.05), 部分绿藻门(如杜氏盐藻)具有耐盐机制, 可以通过调节渗透压来适应高电导率和高盐度环境, 符合河口区绿藻门在盐度梯度中的优势分布模 式[53]。纤毛亚门与 DOC 显著负相关(p＜0.05), DOC浓度降低会导致微生物的可利用碳源减少, 纤毛亚门因为食物资源匮乏而丰度下降; 同时, 较高浓度的 DOC 环境可能伴随异养细菌的爆发性增殖, 与纤毛亚门形成资源竞争[54]。
本文基于宏基因组测序技术, 对灞河上、中、下游真核微生物群落结构、氮代谢功能基因的分布特征以及环境驱动因子开展系统的研究, 得到如下主要结论。
1) 灞河真核微生物群落的多样性和结构呈现显著的空间分异, 下游的 α 多样性显著高于上游。
2) 灞河水体的真核微生物群落以硅藻门、绿藻门和纤毛亚门为主, 在纲水平上, 圆筛藻纲显著丰富。
3) 氮代谢基因的沿程分异特征明显, 上游以氮同化基因主导, 中游呈现氮代谢功能的过渡特性(既具有较强的氮同化基因丰度又具有增强的氮素转运基因丰度), 下游反硝化基因丰度显著升高。
4) TP, NH4+-N 和 NO3--N 显著地影响真核微生物的群落结构, NH4+-N, NO3--N, Chl a, COND 和 Salinity 是驱动氮代谢基因分布的关键因素。
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