图1 采样区域与采样点分布
Fig. 1 Map of sampling regions and sampling sites
北京大学学报(自然科学版) 第62卷 第3期 2026年5月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 62, No. 3 (May 2026)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2026.024
国家自然科学基金(52209078)和西安市青年人才托举计划项目(0959202513029)资助
收稿日期: 2025–03–17;
修回日期:2025–04–18
摘要 基于水化学分析、宏基因组技术及多元统计分析, 系统地研究滇池氮污染状况、氮代谢功能基因与氮代谢细菌的空间分布及其驱动因素。结果表明, 滇池草海的溶解性总氮浓度(4.09mg/L)显著高于外海(1.48mg/L), 分别以硝态氮和可溶性有机氮为主。氮代谢基因呈现显著的空间异质性, 草海中氮异化还原和反硝化基因的相对丰度较高, 而外海中氮同化还原和氨化作用相关基因占据优势。滇池水体中氮代谢细菌主要由变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门构成, 其中产毒蓝细菌 Planktothrix和 Microcystis是主要优势属。Mantel 分析和 Spearman 相关性分析表明, 总氮、硝态氮、铵氮和水温是影响氮代谢基因及氮代谢细菌群落的关键环境因子。
关键词 滇池; 氮代谢; 功能基因; 细菌; 宏基因组
氮循环是维持湖泊生态系统功能的核心过程, 对初级生产力、水质特征和生物多样性具有深远影响[1]。全球人口增长和工业化进程加速了湖泊氮输入, 导致水体富营养化加剧, 进而引发藻类过度生长和生态系统失衡[2–3]。在湖泊生态系统中, 细菌驱动氮的多种生物转化过程, 这些过程共同调控氮的生物可利用性及其在水体中的迁移转化[4]。
滇池是中国云贵高原上最大的淡水湖泊, 在维系昆明市社会经济发展和生态安全中发挥着重要作用。随着流域内农业集约化、工业扩张及生活污水排放等人为活动的加剧, 滇池的氮负荷持续增加, 水体富营养化问题日益突出[5]。尽管近年的治理措施使得水质得到改善, 但高氮含量依旧是制约滇池生态恢复的主要因素, 目前滇池仍然是中国污染最严重的湖泊之一[6]。研究表明, 反硝化是滇池氮去除的主要路径, 其过程受到氮源供给与反硝化微生物活性的协同调控[7]。此外, 滇池沉积物中有机氮具有显著的矿化潜力, 可释放大量 NH₄⁺, 进而影响水生植物与浮游植物群落结构[8]。一些研究者对滇池的微生物群落特征进行初步探索, 揭示其空间分布模式[9–11]及环境影响因素[12–13], 但针对水体氮代谢基因及氮代谢微生物的认知较为有限。
本研究基于宏基因组学方法, 系统地解析滇池水体氮代谢相关微生物群落及功能基因的空间分布规律和驱动机制, 重点探讨氮代谢关键功能基因的丰度分布及氮代谢微生物的分类学特征, 并阐明环境因子对氮循环过程的影响。希望为深入理解湖泊氮循环提供新的科学见解, 并为滇池氮污染治理及水生态系统功能修复提供理论依据。
滇池是云贵高原区典型的富营养化湖泊, 位于云南省昆明市境内(102°31'—102°56'E, 24°32'—25° 17'N), 是中国西南地区最大的高原湖泊[14]。滇池湖面海拔 1886m, 南北长约 39km, 东西最大跨度约为 13.5km, 总面积为 309km2, 由北部的草海(10.8km2)和南部的外海(98.2km2)组成。平均水深4.4m, 湖岸线总长 163.2km。滇池属于金沙江水系, 通过普渡河汇入金沙江干流[15]。
1.2.1 水样采集
依据中国生态环境部推荐的《水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价》(HJ 1296 —2023), 我们于 2023 年 8 月开展滇池水体采样。共设置 23 个采样点, 采用网格化分布, 实现湖区空间全覆盖(图 1)。使用有机玻璃水样采集器, 在每个采样点, 间隔 2m 随机收集 3 份表层水样(每份 4L), 现场混合均匀。一部分水样通过 0.22µm 聚碳酸酯膜(Millipore, USA)过滤, 在 24 小时内收集微生物细胞, 用于 DNA 提取; 剩余水样于 0～4℃条件下保存, 用于理化因子分析。
1.2.2 理化指标测定
水温(WT)、溶解氧(DO)、pH、氧化还原电位(ORP)、总溶解固体(TDS)以及电导率(EC)等水化学参数使用多参数水质监测仪(YSI ProDSS)进行原位测定。透明度(SD)采用直径为 30cm 的黑白相间塞氏盘测定。溶解性总氮(DTN)、硝氮(NO3⁻-N)、亚硝氮(NO2⁻-N)、铵氮(NH4⁺-N)以及溶解性总磷(DTP)依据中国生态环境部推荐的《地表水环境质量标准》(GB3838—2002)进行测定。可溶性有机氮(DON)通过 DTN 与 3 种无机氮 NO3⁻-N, NO2⁻-N 及 NH4⁺-N 的浓度差得到。
图1 采样区域与采样点分布
Fig. 1 Map of sampling regions and sampling sites
根据 FastDNA 试剂盒(MP Biomedical, 美国)的标准流程, 从两个过滤膜中提取环境 DNA。混合DNA 经质量检测合格后, 采用 PE150 策略, 使用Illumina Novaseq 6000 平台进行测序, 每个样本的原始读取量至少为 30Gbp。测序所得原始数据通过MetaWRAP(v1.2.2)[16]中 read_qc 模块进行质量过滤和序列修剪。使用 assembly 模块对质控后的数据进行组装, 并筛选长度大于 500bp 的 contigs, 使用Prodigal (v2.6.3)进行开放阅读框(ORFs)预测[17], 再通过 CD-HIT(v4.8.1)对所得 ORFs 聚类去冗余[18]。使用 metaWRAP(v1.2.2)[16]进行分箱, 获得宏基因组组装基因组(MAGs)。利用 CheckM(v1.1.2)[19]评估完整度与污染率, 只保留完整度≥70%且污染率≤10%的中高质量 MAGs, 用于后续分析。使用dRep (v2.5.4)[20]对所有 MAGs 去冗余(-nc 0.30, -sa 0.95), 并采用 GTDB-Tk (v2.1.0)[21]进行物种注释。针对氮代谢相关的功能基因, 采用 Diamond(v2.1. 6.160)[22]比对 KEGG 数据库(--sensitive, -e 1e-5), 同时使用 EggNOG-mapper (v2.1.9)[23]比对 eggNOG 数据库(-e 1e-5), 筛选功能基因。针对氮循环微生物, 利用 METABOLIC(v4.0)[24]评估 MAGs 氮代谢潜能。采用 Bowtie2(v2.3.5.1)[25]进行序列比对, 再用CoverM(v0.6.1)(https://github.com/wwood/CoverM)计算基因与 MAGs 的相对丰度。
使用 shell 和 R 语言脚本完成宏基因组数据分析及结果可视化。细菌群落的 α-多样性指数(Rich-ness 和 Shannon)通过 R 语言的 vegan 包计算。群落结构使用非度量多维尺度分析(NMDS)进行可视化, 使用相似性分析(analysis of similarity, ANOSIM)评估草海与外海群落差异的显著性。通过 Mantel 分析, 评估环境因子与基因或群落结构间的整体相关性。Spearman 相关性可以用来分析识别关键环境因子与特定基因或细菌类群的响应关系, 分别使用ggcor 和 linkET 包实现。t 检验用于比较两组间的差异显著性。
滇池 23 个点位的理化参数指标测定结果(表 1)表明, 草海水中氮浓度显著高于外海区域。草海水中 DTN 平均浓度为 4.09mg/L, NH4+-N, NO3−-N 和NO2−-N 浓度分别为 0.88, 2.74 和 0.12mg/L, 因此NO3−-N 是草海水中氮的主要形态(在 DTN 中的质量占比为 67%)。该区域毗邻昆明市区, 人口密集, 主要污染源为市政污水系统产生的人类排泄物[26]。外海水中 DTN 平均浓度为 1.48mg/L, NH4+-N, NO3−-N 和 NO2−-N 浓度分别为 0.44, 0.29 和 0.04mg/L。DON 在 DTN 中的质量占比为 49%, 是外海水中氮的重要形态。外海的污染来源主要为农业活动, 包括合成肥料过量施用以及牲畜粪便过量排放造成的有机氮累积[26]。草海和外海水中 DTP 浓度分别为0.06 和 0.05mg/L, 无显著性差异(t 检验, p>0.05)。草海水中 DO 平均浓度为 6.36mg/L, 外海水中 DO平均浓度为 7.16mg/L, 两区域水中溶解氧也无显著差异(t 检验, p>0.05)。外海水温显著高于草海(t 检验, p < 0.05)。营养物质的可用性显著影响湖泊系统中的 N/P 循环途径和相关微生物群落[27], 是导致有害藻华形成的主要因素[28]。有害藻华不仅可以利用无机营养素, 部分藻类还可以利用有机营养素来满足其氮需求[29]。
根据《地表水环境质量标准》(GB3838—2002), 滇池溶解氧含量高, 符合Ⅱ类地表水标准(≥6mg/L)。草海总氮浓度为劣Ⅴ类地表水标准(≥2.0mg/L), 外海总氮浓度达到Ⅳ类地表水标准(≤1.5mg/L), 草海和外海总磷浓度符合Ⅳ类地表水标准。滇池氮磷污染仍然较为严重, 草海的氮污染尤其严重。
表1 滇池水中理化参数指标
Table 1 Physical and chemical parameters in Dianchi Lake
区域浓度/(mg·L−1)WT/℃DTNNH4+-NNO3−-NNO2−-NDTPDO 草海4.09±1.34a0.88±0.54a2.74±1.14a0.12±0.03a0.06±0.01a6.36±1.16a21.30±0.32a 外海1.48±0.40b0.44±0.37a0.29±0.17b0.04±0.03b0.05±0.02a7.16±1.03a22.74±0.41b
说明: 数据为不同区域样品的平均值±标准差(草海, n=4; 外海, n=19); 同一列相同字母表示差异不显著, 不同字母表示差异显著(t 检验, p<0.05)。
采样点水体中氮代谢基因的丰度分布如图 2 所示。总体而言, 与氮同化还原(nirA和 narB)和氨化作用(ureABC和 cynS)相关的功能基因在所有采样点中相对丰度较高, 尤其在部分外海地区。这可能与外海中 DON (如尿素)含量较高有关, 有利于参与相关代谢的细菌繁殖[30]。硝化作用(hao, pmoA-amoA, pmoB-amoB和 pmoC-amoC)与固氮作用(nifDHK)相关基因在多数样本中相对丰度较低, 表明研究区域内固氮和硝化微生物的活性可能受限。一方面, 可能因为富营养湖泊较为浑浊, 光合有效辐射可用性较低, 辐射能不足以支持耗能的氮固定过程。另一方面, 富营养化水域中占主导地位的蓝藻类进行光合作用, 导致溶解氧过饱和, 抑制厌氧菌的氮固定过程[31]。氮异化还原(nirBD和 narGHI)和反硝化作用(nosZ, norBC和 nirS)相关基因在草海样本中相对丰富, 说明该区域可能具有较活跃的硝酸盐还原和反硝化过程。上述结果与张宇等[32]通过 16s rRNA高通量测序技术分析氮循环功能关键基因的结果一致, 可能归因于该地区较高的 NO3−-N 浓度。综上所述, 研究区域内氮代谢功能基因的丰度分布具有显著的空间异质性, 氮循环过程可能受到水体理化环境的调控。
2.3.1 细菌总体群落特征
本研究共识别出 473 个 MAGs, 在此基础上进行细菌群落分析。细菌多样性的分析结果如图 3(a)所示。就 Richness 指标而言, 草海和外海无显著差异, 但是草海细菌群落的 Shannon 指数显著高于外海。NMDS 分析结果显示, 草海和外海细菌群落未表现出显著的空间差异(ANOSIM p = 0.797)。
滇池水中总体细菌群落结构组成如图 3(b)和(c) 所示。在门水平上, 滇池水中细菌群落以 Proteo-bacteria, Bacteroidota 和 Cyanobacteria 为主, 平均相对丰度分别为 24.50%, 13.97%和 50.39%。其中, 外海水体中 Cyanobacteria 门的平均相对丰度(55.52%)高于草海水体(31.92%)。在属水平上, Planktothrix属的平均相对丰度最高(42.78%), 依次是 Fonsibac- ter(10.83%)、微囊藻(Microcystis, 6.21%)、黄杆菌(Flavobacterium, 5.64%)、MAG-120802(1.82%)以及Sphingorhabdus_B (1.81%)。草海的优势属为 Mic-rocystis (20.58%)、Fonsibacter(10.61%)以及 Flavo-bacterium(9.98%); 外海的优势属为 Planktothrix (51.94%)、Fonsibacter(10.89%)以及 Flavobacterium (4.44%)。Fonsibacter在淡水环境中广泛分布, 具有较小的基因组和细胞体积[33]。Planktothrix和 Mic-rocystis都是常见的产毒蓝细菌[34]。滇池流域的亚热带气候为 Microcystis的生长提供了有利条件, 使其能够借助气泡囊在湖面聚集形成大型群落。因此Microcystis能够通过遮蔽非浮游菌属抑制其生长, 并几乎在全年保持优势种群地位[34]。
图2 滇池水中氮代谢基因的丰度分布
Fig. 2 Relative abundances of nitrogen metabolism genes in Dianchi Lake
图3 物种多样性(a)及门水平(b)和属水平(c)物种组成
Fig. 3 Diversity (a) and taxonomic composition at the phylum (b) and genus (c)
2.3.2 氮代谢细菌群落特征
共识别 159 个 MAGs 具有氮代谢潜能, 参与 7种氮代谢过程, 数量占比 33.62% (图 4(a))。具有氨化作用潜能的 MAGs 最多, 共 82 个, 占比 17.34%。其次是氮异化还原(62 个, 13.11%)、硝酸盐还原(38个, 8.03%)、氧化亚氮还原(28 个, 5.92%)、一氧化氮还原(27 个, 5.71%)、亚硝酸盐还原(12 个, 2.54%)和固氮作用(7 个, 1.48%)。图 4(b)显示氮代谢细菌的相对丰度, 氨化细菌的相对丰度最高(20.80%～ 79.78%), 尤其在部分外海样本中(DC6 和 DC7 等)。具有氮异化还原、硝酸盐还原、一氧化氮还原、氧化亚氮还原、亚硝酸盐还原和氮固定潜能的细菌的平均相对丰度依次为 8.07%, 3.98%, 3.18%, 2.71%, 1.19%和 0.49%。
进一步对氮代谢细菌进行分类学识别, 发现氨化细菌主要属于 Cyanobacteria 门中的 Planktothrix,Microcystis和 Pseudanabaena属, 其次为 Proteobac-teria 门 Rhodoferax和 Aestuariivirga属(图 4(c))。氨化细菌可通过分解有机氮物质, 释放 NH₄⁺, 为其他氮循环过程提供底物。固氮细菌主要属于 Cyano-bacteria 门的 Raphidiopsis属和 Dolichospermum属。研究表明, Raphidiopsis是高氮环境中的优势固氮蓝藻[35], 可通过调节固氮活动影响滇池氮素平衡。氮异化还原细菌主要属于 Chloroflexota 门的 CFX5和Caldilinea属, Proteobacteria 门的 Arenimonas, Parar-heinheimera, Rhodoferax和 Undibacterium属。氮异化还原细菌通过将 NO2−还原为 NH4+, 有助于在缺氧环境中保留可利用的氮素。反硝化过程涉及多个还原步骤, 不同的阶段由不同的微生物主导。硝酸盐还原细菌主要属于 Proteobacteria 门的 VBCG01, Pararheinheimera和 Rhodoferax属[36–37]; 亚硝酸盐还原细菌主要属于 Proteobacteria 门的 Arenimonas, Rhodoferax和 Rubrivivax属等; 一氧化氮还原细菌主要属于 Bacteroidota 门的 Flavobacterium和 Fer-ruginibacter属, 以及 Proteobacteria 门的 Arenimonas属等; 氧化亚氮还原细菌主要属于 Bacteroidota 门的 Flavobacterium, Ferruginibacter, Daejeonella和Allopseudarcicella属等[38]。
图4 具有氮代谢潜能的基因组比例(a)、累积相对丰度(b)及物种分类(c)
Fig. 4 Proportion (a), cumulative relative abundance (b), and taxonomic classification (c) of MAGs with nitrogen metabolic potential
理化因子分析结果显示, TDN 分别与 NO3−-N, NO2−-N 和 NH4+-N 显著正相关, 并与 WT, DO, TDS和 pH 显著负相关(图 5(a))。对氮代谢基因及氮代谢细菌分别进行 Mantel 分析, 结果表明, TDN, NO3−-N, NO2−-N, NH4+-N, WT 和 pH 显著影响氮代谢基因, TDN, NO3−-N, NO2−-N 和 WT 显著影响氮代谢细菌。细菌群落结构受生物和非生物因素的共同调控, 影响因素包括温度、溶解氧、磷、无机氮及总氮浓度、电导率和 pH 值[39]。温度是影响蓝藻水华动态的重要因素, 水温升高促进蓝藻水华形成[40]。
进一步对理化因子与氮代谢过程相关的基因和细菌群落进行 Spearman 相关性分析(图 5(b)和(c))。反硝化作用相关的基因丰度与 TDN (r = 0.51), NO3−-N (r = 0.58), NO2−-N (r = 0.62)以及 NH4+-N (r = 0.61)显著正相关, 与 WT 显著负相关(r = −0.46)。氮同化还原相关的基因丰度与 TDN (r = 0.48), NO3−-N (r = 0.54), NO2−-N (r = 0.62)和 NH4+-N (r = 0.61)显著正相关。氨化作用(r = −0.43)和氮同化还原(r = −0.54)相关的基因丰度与 NH4+-N 显著负相关。类似地, 反硝化细菌(如参与硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、一氧化氮还原和氧化亚氮还原过程)均与 NO3−-N, NO2−-N 和 NH4+-N 显著正相关。NO3−-N 和 NO2−-N的浓度是影响富营养化湖泊反硝化群落的关键因素, 最终导致不同的氮去除率[41]。
1)滇池水体氮污染形势较为严峻, 不同水域的氮污染特征呈现显著的空间异质性。草海水体氮浓度显著高于外海, 硝氮构成草海氮的主要赋存形态, 而外海的氮主要以有机氮为主。
2)不同类型氮代谢功能基因在滇池水体中呈现出差异化的分布特征。氮同化还原(nirA和 narB)和氨化作用(ureABC和 cynS)相关基因在所有采样点中相对丰度较高。草海表现出更高的氮异化还原(nirBD和 narGHI)和反硝化作用(nosZ, norBC和nirS)潜能, 外海表现出更高的氮同化还原(nirA)潜能。
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
图5 环境因素对氮代谢基因和细菌群落(a)以及对参与特定氮代谢过程的基因(b)和细菌群落(c)的影响
Fig. 5 Effects of environmental factors on nitrogen metabolism genes and bacterial communities (a), genes involved in specific nitrogen metabolic processes (b), and the corresponding bacterial communities (c)
3)滇池水体氮代谢细菌群落主要由变形菌门、拟杆菌门和蓝藻门构成。在属水平上, 能产生毒素的非固氮蓝细菌 Planktothrix和 Microcystis在滇池占据主导地位。
4)TDN, NO₃⁻-N, NO₂⁻-N, NH₄⁺-N, WT 和 pH 显著影响氮代谢相关基因和氮代谢细菌群落结构, 尤其是反硝化过程(如硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、一氧化氮还原和氧化亚氮还原)。
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Community Structure, Functional Gene Distribution, and Influencing Factors of Nitrogen-metabolizing Bacteria in Lake Dianchi Water
Abstract Based on water chemistry analysis, metagenomic techniques, and multivariate statistical analysis, this study systematically investigated the spatial distributions of nitrogen pollution, nitrogen metabolism genes, and bacterial communities, as well as their environmental drivers in Dianchi Lake. We found that the total dissolved nitrogen concentration in Caohai (4.09 mg/L) was significantly higher than that in Waihai (1.48 mg/L), with nitrate nitrogen (NO₃⁻-N) and dissolved organic nitrogen (DON) as the dominant forms, respectively. Nitrogen metabolism genes exhibited significant spatial heterogeneity, with higher relative abundances of dissimilatory nitrogen reduction and denitrification genes in Caohai, whereas genes related to assimilatory nitrogen reduction and ammonification were more dominant in Waihai. Nitrogen metabolism bacteria were mainly composed of Proteobacteria, Bacteroidota, and Cyanobacteria, with the toxin-producing cyanobacteria Planktothrix and Microcystis as the dominant genera. Mantel analysis and Spearman correlation analysis indicated that TDN, NO₃⁻-N, ammonium (NH₄⁺-N) and water temperature were the key environmental factors influencing nitrogen metabolism genes and bacteria.
Key words Dianchi Lake; nitrogen metabolism; functional genes; bacteria; metagenomes