菲与沉积物微生物群落关系的微观模拟研究

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 61, No. 6 (Nov. 2025)

菲与沉积物微生物群落关系的微观模拟研究

1.北京大学环境科学与工程学院, 区域环境安全全国重点实验室, 北京 100871; 2.交通运输部水运科学研究院, 北京 100088; 3.塔吉克斯坦科学院水问题、水能和生态研究所, 杜尚别 734042; †通信作者, E-mail: xiesg@pku.edu.cn

摘要以菲(PHE)为代表性多环芳烃(PAHs)污染物, 构建水–沉积物微观模拟体系, 采用 16S rRNA 和 18S rRNA 测序技术, 研究 PHE 对水质以及沉积物微生物群落多样性、结构和功能的影响。结果表明, PHE 污染改变了上覆水水质参数的数值及其稳定性; PHE 主要吸附在沉积物中, 且培养到第 56 天时, 各处理组中沉积物的 PHE 降解率均达到 99%。不同处理组间的细菌群落(RANOSIM=0.293, P=0.002)和真菌群落(RANOSIM=0.147, P=0.031)存在显著差异。PHE 处理组中多种与 PHE 降解相关的细菌、古菌和真菌的相对丰度高于对照组。与对照组和低剂量处理组(PHE(L))相比, 中、高剂量处理组(PHE(M)和 PHE(H))的微生物网络表现出更高的平均聚类系数和更强的正相关关系。在培养后期, PHE(M)和 PHE(H)组中碳固定、氮代谢和硫代谢等功能的相对丰度较低, 而甲烷代谢功能的相对丰度较高。pH 是影响细菌、古菌和真菌群落结构和功能的关键因子, 其次是 NH4+-N。

关键词 多环芳烃; 菲污染; 沉积物; 微生物群落和功能; 共现网络

石油在开采、运输和炼制过程中的泄漏会导致严重的环境污染。在石油污染场地中, 常常释放出多种有机污染物, 包括脂肪烃、芳香烃、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)以及酚类等[1]。PAHs 因具有亲脂性、致癌性和致突变性而受到广泛关注[2]。此外, PAHs 水溶性较低, 易在沉积物中积累, 进而影响沉积物中的微生物群落。在石油泄漏区域的水体、沉积物和土壤中, PAHs 被广泛检出。2007 年韩国西部沿海石油泄漏事故发生后半年内, 近海沿岸沉积物中总 PAHs 含量为 0.001～ 100μg/g; 事故发生 5 年后, 仍然检测到 0.001～0.1μg/g 的总 PAHs 浓度[3]。Michel 等[4]发现, 2000 年美国马里兰州石油泄漏事故发生 7 年后, 其表层和深层沉积物中总 PAHs 浓度分别高达 453μg/g 和 2921μg/g。

一方面, 石油和 PAHs 污染会影响沉积物和土壤的微生物群落多样性、结构和功能, 干扰生物地球化学循环过程。原油污染导致微生物群落多样性降低[5], 化能异养细菌的比例下降, 而光能异养细菌(主要是 Rhodospirillales)的比例上升[6]。Liu 等[7]的研究表明, PAHs 污染对河流沉积物中参与氮磷代谢相关的细菌和功能基因有负面影响, 而对与硫代谢有关的细菌和硫还原基因表现出显著正面影响, 这可能导致河流中氮和磷的积累以及黑臭现象。石油污染对微生物群落的影响具有长期性。Girsowicz等[8]发现, 因溢油而被污染的土壤 40 年后仍然处于生物修复过程中, 其微生物群落受到的破坏比受近期石油泄漏影响的土壤更严重。

另一方面, 石油和 PAHs 污染也会导致降解菌的富集。2007 年河北油轮石油泄漏事故发生后 4 个月, 滩涂沉积物中 Alcanivorax, Cycloclasticus, Pseu-domonas 和 Thalassolituus 等石油降解菌属的比例显著增加[9]。此外, 在 PAHs 污染的沉积物中, 微生物群落的关键物种与 PAHs 的生物降解过程及铁循环有关[10]。

菲(phenanthrene, PHE)是一种典型的三环多环芳烃, 也是石油的重要组分[11]。因此, 本研究选择PHE 作为 PAHs 的代表物, 研究不同浓度的 PHE 对沉积物微生物群落多样性、结构和功能以及上覆水水质的影响。以往的研究大多集中于细菌群落对石油和 PAHs 污染的响应, 而关于石油和PAHs对真菌和古菌影响的研究较少。本研究除关注细菌群落外, 还研究真菌和古菌对 PHE 污染的响应, 以期更好地理解石油污染对细菌、古菌和真菌群落结构及其主导的生物地球化学循环过程的影响, 并揭示细菌、古菌和真菌在石油和 PAHs 降解中的作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

沉积物和上覆水样品采自北京大学校内的荷花池。沉积物样品装入密封袋中, 搅拌均匀后备用。PHE(纯度≥95%)购自上海笛柏生物科技有限公司。将 PHE 溶解于甲醇, 配置成浓度为 5mg/mL 的甲醇储备液。上覆水样品中 NH4+-N, NO2−-N, NO3−-N, TP和 TOC 的浓度分别为 1.098, 0.143, 3.189, 0.135 和 3.535mg/L, pH 值为 8.25。沉积物含水量为 37.2%。沉积物和上覆水的 PHE 浓度均低于高效液相色谱法(high per-formance liquid chromatography, HPLC)的检出限。

1.2 微观模拟试验设计

在 150mL 锥形瓶中加入 50g 沉积物样品(湿重)、100mL 上覆水样品以及不同剂量的 5mg/mL PHE 甲醇储备液, 使得体系的 PHE 浓度分别为 10, 100 和500μg PHE/g 沉积物(湿重), 或者相当于 5, 50, 250μg PHE/mL 上覆水。相应地, 设置低剂量处理组(PHE(L))、中剂量处理组(PHE(M))和高剂量处理组(PHE(H)), 对照组不加 PHE 甲醇储备液。PHE 浓度的设定参考石油泄漏事件后不同污染程度沉积物和土壤中 PAHs 的浓度范围[3–4]。

将所有锥形瓶放在空气浴恒温摇床(25℃, 100rpm)中培养。在第 1, 7, 14, 28 和 56 天取样, 经3000rpm 离心分离上清液和沉淀物。上清液用于测定pH, NH4+-N, NO2−-N, NO3−-N, TP, TOC 和 PHE 浓度, 沉淀物分为两份, 一份用于测定 PHE 浓度, 另一份保存于−20℃, 以备后续测序分析。每个样品设 3个平行组, 共 60 个微观模拟装置。

1.3 样品分析方法

1.3.1 水质指标的分析

采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)测定NH4+-N, 分光光度法(GB 7493-87)测定 NO2−-N, 紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)测定 NO3−-N, 钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)测定 TP, 用 TOC-LCPH有机碳分析仪测定 TOC。

1.3.2 菲(PHE)的测定

上清液中 PHE 的测定方法参照文献[12]。取 2mL 上覆水样, 加入 2mL 二氯甲烷, 超声萃取 20 分钟, 静置 5 分钟后取下层液体 1mL, 用 0.22μm 有机系滤膜过滤后进行 HPLC 分析。沉淀物中 PHE 的测定方法[13]如下: 称取 3g 沉积物(湿重), 加入 3mL 二氯甲烷, 超声萃取 20 分钟, 重复萃取两次, 5000rpm离心分离 10 分钟。对照组和 PHE(L)组取上清液 1mL, PHE(M)组和 PHE(H)组取上清液 200μL, 用甲醇稀释 5 倍后, 经 0.22μm 有机系滤膜过滤, 再进行HPLC 检测。检测条件如下: 色谱柱为 Venusil XBP- C18(4.6×250mm, 5μm), 流动相为甲醇–水(80/20, V/V), 流速为 1.0mL/min, 进样量为 20μL, 柱温30℃, 检测波长 254nm。水相和沉积物中 PHE的平均回收率为 99.7%。

采用广泛使用的引物 338F/806R, Arch519F/Arch 915R 和 ITS1F/ITS2R, 分别对细菌 16S rRNA、古菌16S rRNA 和真菌 18S rRNA 的基因进行扩增子测序, 并分析微生物群落。

1.4 数据分析

参照文献[14], 采用 QIIME2(v2023.07)对测序数据进行分析。首先, 将双端序列转换为 QIIME2可识别的文件格式, 使用 DADA2 进行质量控制并生成 ASV 表。在统一测序深度下, 计算核心多样性指数, 选取香农多样性指数(Shannon)和均匀度指数(Evenness), 分别评估细菌、古菌和真菌群落的丰富度和多样性。使用 gg 13_5 和 UNITE 数据库, 对细菌、古菌和真菌群落进行物种注释。

基于 Bray-Curtis 相似性, 使用 R 语言中的 ade4包和 vegan 包进行主坐标差异分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM), 比较各组细菌、古菌和真菌群落的差异。选取在 30%以上样品中出现的 ASVs, 借助 R 中的 igraph 包构建共现网络, 并用 Gephi 可视化网络。网络分析只保留具有稳健性(|r|>0.6)和统计显著(P < 0.01)的相关性连接[15]。

每个网络中的关键节点依据模块内连通性(wi-thin-module degree z-score, Zi)和模块外连通性(parti-cipation coefficient, Pi)确定。根据 Zi 和 Pi 值, 每个网络中的节点分为四类。1)外围节点(Peripherals, Zi≤2.5, Pi≤0.62); 2)连接节点(Connectors, Zi≤2.5, Pi>0.62); 3)模块中心点(Module hubs, Zi>2.5, Pi≤0.62); 4)网络中心点(Network hubs, Zi>2.5, Pi>0.62)。连接节点、模块中心点和网络中心点被视为网络中的关键物种[16]。

基于细菌 16sRNA 的代表性序列文件和特征表文件, 使用 PICRUSt2(v2.5.1)进行功能预测分析[17], 并通过 KEGG 数据库, 对预测得到的功能基因进行注释。通过冗余分析(redundancy analysis, RDA)和曼特尔检验(Mantel), 探究微生物群落结果和功能与上覆水水质之间的相关性。

2 结果与讨论

2.1 上覆水水质和沉积物 PHE 浓度的变化

如图 1(a)～(c)所示, 56 天内 PHE 处理组上覆水中的 NH4+-N, NO2−-N 和 NO3−-N 浓度波动幅度大于对照组, 尤其是 PHE(H)组, 其 NO3−-N 浓度呈显著上升趋势。所有处理组的 TP 浓度都呈现先上升后下降的趋势。第 56 天, 总磷(total phosphorus, TP)浓度表现为 PHE(H)>PHE(M)>PHE(L)>对照组, 如图1(d)所示。TOC 浓度始终表现为 PHE(H)>PHE(M)> PHE(L)>对照组, 且各 PHE 处理组的 TOC 浓度都随培养时间延长而下降(图 1(e))。各处理组上覆水中的 PHE 浓度及对照组和 PHE(L)组沉积物中的 PHE浓度都低于 HPLC 检出限; PHE(M)和 PHE(H)组沉积物中的 PHE 浓度随时间延长而下降, 到第 56 天, 两组的 PHE 降解率均超过 99% (图 1(f))。PHE的加入影响了水质指标的数值及其稳定性, 这可能源于PHE 对沉积物氮磷的吸附行为以及沉积物微生物群落结构和功能的改变。PHE 处理组中 TOC 和 PHE的浓度都随时间延续而下降, 且 PHE 主要吸附在沉积物中, 推测与沉积物微生物群落对 PHE的吸附和降解作用有关。研究表明, PHE 污染土壤与未污染土壤的微生物多样性和群落存在显著差异, 污染土壤中检测出更多样的 PHE 降解微生物[18–19]。Shi 等[20]指出, PHE 因其疏水性易在污泥中富集。Ti-ralerdpanich 等[21]利用红树林沉积物降解 150μg/g 的PHE, 21 天后去除效率高达 99.14%。各组上覆水 pH值的变化情况见附录 1。

2.2 沉积物微生物多样性和群落结构的变化

如表1 所示, PHE(L)组和 PHE(M)组以及第 1～ 28 天的 PHE(H)组中, 细菌、古菌和真菌的 Shannon指数和 Evenness 指数与对照组无明显差异; PHE(H)组在第 56 天时, 细菌、古菌和真菌的 Shannon 指数和 Evenness 指数均低于其他处理组。这说明 PHE对微生物多样性的影响可能与浓度和暴露时间均有关, 1～56 天的低浓度和 1～28 天高浓度的 PHE 暴露对微生物多样性未产生显著影响, 但 56 天的高浓度PHE 暴露导致微生物群落多样性降低。Shi 等[20]的研究结果表明, 41 天低浓度(0.3mg/L) PHE 的暴露不会改变厌氧污泥中原核微生物群落的多样性, 而延长暴露 76 天且在中低浓度 PHE (3～30mg/L)的条件下, 原核微生物群落的多样性升高。Schwarz 等[19]发现, 沙质土壤在高浓度 PHE (750mg/L)中暴露 25天后, 细菌和真菌群落多样性都下降。中低浓度PHE 的长期暴露促进低丰度降解菌和不敏感菌的繁殖, 从而使微生物群落更加多样化[22]; 高浓度 PHE的长期暴露则导致不耐受菌的丰度下降, 进而引起微生物群落多样性降低。

不同处理组的细菌群落(RANOSIM=0.293, P=0.002)和真菌群落(RANOSIM = 0.147, P = 0.031)存在显著差异(图 2)。虽然各处理组古菌群落整体上无显著差异, 但是 PHE(H)组在第 28 天和第 56 天以及PHE(M)组在第 14 天和第 28 天, 古菌群落与其他组存在明显差异。不同采样时间点的细菌、古菌和真菌群落均未表现出显著差异。Qian 等[23]报道, 在 1mg/L PHE 暴露下, 浮游细菌群落与对照组存在显著差异(R2ANOSIM=0.042, P=0.001)。Liu 等[7]对珠江流域 PAHs 不同污染程度区域的细菌群落结构进行比较, 发现重污染区与轻污染区之间的细菌群落结构存在显著差异(RANOSIM = 0.456, P = 0.001)。

如图 3(a)所示, 主要的细菌门包括变形杆菌门(Proteobacteria, 16.86%～50.43%)、放线菌门(Actino-bacteria, 4.99%～28.89%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 1.73%～20.70%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 0.61%～ 17.38%)和厚壁菌门(Firmicutes, 3.43%～52.36%), 共占细菌群落的 76.5%～91.4%, 这一组成与文献[21, 24]报道的受 PHE 或 PAHs 污染的沉积物或土壤中主要细菌门类似。厚壁菌门的相对丰度随 PHE浓度增加呈上升趋势, 且在 PHE(M)组和 PHE(H)组中随时间延长也持续增加, 说明厚壁菌门中可能存在潜在的 PHE 降解菌。在属于厚壁菌门的两个纲芽孢杆菌纲(Bacilli, 1.02%～10.43%)以及梭菌纲(Clo-stridia, 1.51%～48.96%)中, 已报道多个 PAHs 降解菌属, 如 Bacillus,Paenibacillus, Clostridium 和 Fusiba-Cter 等。梭菌纲的相对丰度随着 PHE 浓度的增加呈上升趋势(附录 2)。Tiralerdpanich 等[21]的研究表明, 柴油和 PAHs 的暴露会显著地提高厚壁菌门(尤其是梭菌纲)的相对丰度。Clostridium 属与PAHs 的降解速率显著正相关(P<0.03)[25], 且利用该属进行生物强化可促进 PHE 的降解[26]。Fusi-bacter 属是从油井中分离出来的[27], 在长期的石油暴露中其相对丰度增加, 且可能参与 PAHs 的厌氧降解[28–29]。

其他主要的细菌纲, 例如 α-变形杆菌纲[30–31](Alphaproteobacteria, 3.19%～11.55%)、γ-变形杆菌纲[32–34](Gammaproteobacteria, 0.66%～6.89%)和放线菌纲[34–35](Actinobacteria, 3.26%～12.07%)中也被报道有多种 PAHs 和 PHE 降解菌[36]。主要的细菌属如图 3(b)所示, 其中相对丰度大于 1%的细菌属有 Gai-ellaceae. Uclaassifed (0.61%～7.13%)、Methylotenera(0.00%～37.94%)、Flavobacterium (0.22%～2.68%)、Acetobac-terium(0.04%～29.21%)以及 Trichococcus (0.29%～7.60%)。细菌属Acetobacterium, Dehalobac-terium 和 Desulfosporosinus 的相对丰度随着 PHE 浓度的增加和时间的延长均呈现上升趋势。此外, 细菌属Pseudomonas [37], Microbacterium[38], Flavobacte-rium[39], Hydrogenophaga[40]和 Fusibacter[41]等被报道为潜在的 PAHs 和 PHE 降解菌, 其在 PHE 处理组中的相对丰度高于对照组, 尤其在 PHE(M)组和 PHE (H)组中具有较高的相对丰度(附录 3)。Chebbi 等[42]的研究结果表明, Pseudomonas W10 能产生生物表面活性剂, 从而高效地降解 PAHs; 该菌能以 PHE为唯一碳源, 在 30 天内降解 80%的 PHE。

如图 4(a)所示, 样品中主要的古菌门为泉古菌门(Crenarchaeota, 9.68%～97.62%)和广古菌门(Eur-yarchaeota, 2.38%～90.31%), 两者占比超过99%。在PHE(M)组和 PHE(H)组中(尤其第 14 天后), 广古菌门取代泉古菌门成为主要的古菌门, 这一变化主要源于产甲烷古菌属 Methanomicrobia 和 Methano- bacteria 相对丰度的上升。Candidatus Nitrososphaera(7.77%～87.88%), Methanobacteriaceae.Unclassified (0.00%～79.70%)和 Methanomethylovorans (0.00%～40.78%)是主要的古菌属。与对照组相比, PHE 处理组中多个产甲烷菌属(Methanobacteriaceae. Unclas-sified, Methanospirillum, Methanobacterium, Metha-nomethylovorans, Methanolobus, Methanocella 和 Me-thanosaeta)的相对丰度更高(图 4(b))。产甲烷菌相对丰度的增加拓展了 PHE 的代谢途径。一方面, 在产甲烷环境中, 厌氧硝化反应过程的中间产物醋酸盐可以促进 PHE 的降解[43]。另一方面, 电活性微生物(如 Geobacter 等)与产甲烷菌(如 Methanosaeta 等)之间可通过直接种间电子转移机制, 加速 PHE的降解[44]。

如图 5(a)所示, 主要的真菌门是子囊菌门(As-comycota, 30.30%～85.50%)、球囊菌门(Glomeromy-cota, 0.29%～11.89%)以及担子菌门(Basidiomycota, 0.08%～6.21%)。在 PHE 处理组(尤其是 PHE(H)组后期), 子囊菌门的相对丰度高于对照组, 而球囊菌门的相对丰度低于对照组。据报道, 子囊菌门中存在多种 PAHs 和 PHE 降解菌, 如 Fusarium sp. [45], Peni-cillium sp. [46]和 Aspergillus sp. [47]等。主要的真菌属如图 5(b)所示, 相对丰度大于 1%的真菌属包括 Hy- aloscyphaceae.Uclassified, Dentiscutata, Neocucurbi-taria, Penicillium 和 Helminthosporium, 其中 Penicil-lium 中已报道多个 PAHs 和 PHE 降解菌, 且在 PHE (M)组和 PHE(H)组中(尤其是 PHE(H)组)表现出较高的相对丰度。Kumar 等[46]从印度炼油厂分离出 Peni-cillium citrinum, 发现其能分泌表面活性剂, 表现出较强的油脂降解能力。Zheng 等[48]的研究结果表明, 从含油废渣的土壤中分离得到的 Penicillium sp. 06能在 30 天内对 30mg/L 的 PHE 实现 89%的去除率。能降解 PAHs 的真菌可分为木质素降解真菌和非木质素降解真菌[49]。木质素降解真菌(如 Basidiomy-cota 等白腐真菌)可以通过分泌胞外木质素降解酶(如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶等)来催化环氧化、羟化和脱烷基等反应, 从而对 PAHs进行降解[50]。非木质素降解真菌(如真菌属 Penicil-lium)则采用与哺乳动物相似的代谢机制, 使用细胞色素 P450 单加氧酶生成环氧芳烃, 作为降解 PAHs的第一步[51]。

2.3 分子生态网络分析

为验证实际网络并非随机形成, 采用 igraph 包构建 1000 个随机网络, 每个随机网络与实际网络具有相同的节点数和边数。实际网络和随机网络的拓扑参数以及不同处理组的微生物共现网络分别如表2 和图 6 所示。分析结果表明, 实际网络的平均聚类系数、平均路径长度和模块化系数都高于随机网络, 表明这些网络是非随机的, 具有重要的生态学意义。节点数和边数反映网络的规模和复杂程度。与对照组相比, PHE 处理组的节点数、边数和平均节点度更高, 说明 PHE 处理组的网络规模更大, 结构更复杂。在网络中, 模块内部的节点彼此高度连接, 但与模块外节点的连接较弱[16]。有研究表明, 同一模块内的微生物可能执行相似的功能, 模块越多, 模块化程度越高, 网络越稳定[52]。模块数和模块化系数都随 PHE 浓度的升高呈先上升后下降的趋势, 这说明低浓度的 PHE 可能有利于维持生态网络的稳定性, 中、高浓度的 PHE 则对其稳定性产生破坏作用。同时, 正相互作用的比例随 PHE 浓度升高呈现先降后升的趋势, 这表明在中、高浓度 PHE条件下, 微生物倾向于通过协作抵抗不利环境。在4 个生态网络中, 微生物之间的相互关系绝大多数(81.42%～94.50%)为正相关, 说明微生物倾向于共现(co-occurrence, 如共生、互惠共生等), 而非相互排斥(co-exclusion, 如竞争)。本文研究结果与 Yan等[10]的发现相似, 即高浓度 PAHs 污染条件下的河流沉积物微生物群落表现出更高的节点数、边数、平均节点度、图密度、平均聚类系数和正相关性, 说明高浓度 PAHs 可能促使微生物形成更复杂和更紧密的生态网络。

每个网络中, 大多数节点都是外围节点(占比为 99.26%～100%), 且未检测到网络中心点(图 7)。对照组检测出 2 个连接节点(分别属于酸杆菌门和广古菌门), PHE(L)组检测出 4 个模块中心点(都属于变形杆菌门), PHE(M)组检测出一个连接节点(属于厚壁菌门), 4 个网络之间没有相同的关键节点。Yi 等[53]也发现, 对照组的关键物种来自酸杆菌门, 而低浓度(4mg/g) PHE 处理组的关键物种来自变形杆菌门。变形杆菌门因其代谢多样性, 在土壤碳、氮、硫循环中发挥重要作用, 参与许多有机污染物的降解过程[30,33,54–55]。所有关键物种的相对丰度都较低(0.004%～1.239%), 表明某些低丰度物种可能在微生物群落的形成中具有关键作用。

2.4 沉积物微生物群落功能的变化

如图 8(a)所示, 与对照组相比, PHE(M)组和PHE(H)组在后期表现出较低的遗传信息处理功能, 表明微生物群落的遗传功能受到潜在的干扰。在环境信息处理和细胞过程功能方面, 膜运输、细胞生长和死亡、细胞运动、运输以及分解代谢等功能在PHE(M)组和 PHE(H)组后期富集, 有利于微生物群落对环境的适应, 并促进群落演替。然而, 信号转导、信号分子与相互作用等功能受到抑制。在 PHE (M)组和 PHE(H)组, 尤其是 PHE(H)组的后期, 微生物群落表现出更强的能量代谢和更低的氨基酸代谢、脂质代谢以及碳水化合物代谢, 这与 Shi 等[20]的研究结论一致。能量代谢中, 碳固定、氧化磷酸化、氮代谢和硫代谢等功能在 PHE(M)和 PHE(H)组后期的相对丰度降低, 而甲烷代谢功能的相对丰度升高(图 8(b)), 说明 PHE 可能抑制了微生物参与元素地球化学循环。甲烷代谢功能的增强可能与产甲烷菌在 PHE(M)和 PHE(H)组后期相对丰度的上升有关。尽管 PHE(H)组后期氮代谢功能整体下降, 但与固氮相关的基因(如 nifD, nifH 和 nifK)的相对丰度增加(附录 4), 说明此时微生物群落具有较强的固氮潜力, 这可能是 PHE(H)组后期 NH4+-N, NO2−-N和 NO3−-N 浓度升高的原因。

此外, 各组中均存在一定量的 PHE 好氧和厌氧降解基因, 说明 PHE 的降解可能同时通过好氧降解和多电子受体耦合的厌氧降解途径进行(图 8(c))。初始双加氧酶[EC:1.14.13 和 EC:1.13.11.16]在各组中相对丰度较高, 而开环双加氧酶(如儿茶酚双加氧酶[EC:1.13.11.1 和 EC:1.13.11.2]、原儿茶酚双加氧酶[EC:1.13.11.3 和 EC:1.13.11.8]和龙胆酸双加氧酶[EC:1.13.11.4])的相对丰度较低, 表明PHE 难以被完全有氧降解。PHE 的降解主要通过儿茶酚和邻苯二甲酸途径, 依赖儿茶酚 2,3-双加氧酶[EC: 1.13.11.2]和原儿茶酸 3,4-双加氧酶[EC:1.13.11.3]实现, 这可能与 Pseudomonas 在 PHE 降解中的关键作用有关。Thomas 等[56]研究的结果表明, 从污染土壤中分离出的 13 株 Pseudomonas 均检测到儿茶酚2,3-双加氧酶[EC:1.13.11.2]和原儿茶酸 3,4-双加氧酶[EC:1.13.11.3]基因, 但缺失儿茶酚 1,2-双加氧酶基因[EC:1.13.11.1]。龙胆酸双加氧酶[EC:1.13.11.4]基因的相对丰度较低, 说明不是 PHE降解的关键途径。在厌氧降解方面, 硫酸腺苷基转移酶[EC: 2.7.7.4]、硝酸还原酶[EC:1.7.99.4]、2-氧戊二酸铁氧还蛋白氧化还原酶[EC:1.2.7.3]和丙酮酸铁氧化还蛋白氧化还原酶[EC:1.2.7.1]基因的相对丰度较高, 在 PHE 的厌氧降解中发挥重要作用。主要细菌属Desulfosporosinus[57], Geobacter[58], Pseudomonas[59]和 Fusibacter[60]可能参与硫酸盐、硝酸盐和铁的还原过程。在 PHE(L)、PHE(M)和 PHE(H)组的前期, 好氧降解以及与硫酸盐、硝酸盐还原有关的厌氧降解占主导; 在 PHE(H)组的后期, 与铁还原有关的厌氧降解发挥更重要的作用。

2.5 微生物群落和功能与环境因子的相关性分析

RDA 分析结果显示, 所有坐标轴对细菌、古菌以及真菌群落的解释率分别为 38.53%, 38.42%和42.46%。Mantel 分析结果(表3)表明, pH 是影响细菌、古菌和真菌群落的关键因子, 其次是 NH4+-N。

如图 9(a))所示, 在第 56 天, PHE(H)组在 pH轴上的投射值明显低于其他组, 而在 NH4+-N 轴上的投射值明显高于其他组, 表明长时间暴露在高浓度 PHE环境下时, 可能通过影响环境中 pH 值和 NH4+-N 浓度而影响细菌群落。长时间暴露在高浓度 PHE 环境下导致 pH 降低, 可能是由于 PHE 在好氧和厌氧降解过程中产生有机酸或其他酸性代谢产物; NH4+-N浓度升高则可能与微生物固氮能力增强有关(如nifD, nifH, nifK 等固氮相关基因的相对丰度上升)。有研究指出, pH 和营养物质对微生物群落的组成具有重要影响[61–62]。pH 还可显著地影响微生物群落的功能, 包括碳、氮和硫的代谢过程以及与硫酸盐还原、硝酸盐还原、铁还原和 PHE 氧化有关的降解基因丰度[63–65]。Zhou 等[66]也证实, pH 是影响群落功能的关键因素(P<0.01)。此外, 共现网络中的关键物种也与 pH 和 NH4+-N 显著相关。

3 结论

本研究系统地评估了不同浓度的 PHE 污染对沉积物微生物群落结构和功能及上覆水水质的综合影响，主要结论如下。

1)外加 PHE 对微观模拟装置中上覆水的水质指标及其稳定性产生影响。在 56 天高浓度 PHE 暴露条件下, 上覆水中 NH4+-N 和 NO3−-N 浓度增加, pH 降低, 沉积物中微生物群落多样性降低。Mantel分析结果表明, pH 和 NH4+-N 是细菌、古菌和真菌群落结构的主要环境驱动因子。

2)PHE 主要被沉积物吸附, 56 天时, PHE 处理组中的 PHE 降解率达到 99%。在这些处理组中, 与PHE 降解相关的细菌属(如 Pseudomonas, Fusibacter等)、古菌属(如产甲烷菌 Methanosaeta 等)和真菌属(如 Penicillium 等)的相对丰度高于对照组。

3)不同处理组的细菌群落(RANOSIM = 0.293, P = 0.002)和真菌群落(RANOSIM = 0.147, P = 0.031)存在显著差异。中高浓度 PHE 暴露破坏了生态网络的稳定性, 形成更复杂、更紧密的微生物网络。

4)与对照组相比, 在中高浓度 PHE 的培养后期, 能量代谢中碳固定、氧化磷酸化、氮代谢和硫代谢功能的相对丰度降低, 而甲烷代谢功能的相对丰度升高。所有处理组中均检测到 PHE 好氧和厌氧降解基因。

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Effects of Phenanthrene on Sediment Microbial Community:Microcosm Simulation Study

1. State Key Laboratory of Regional Environmental and Sustainability, College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871; 2. China Waterborne Transport Research Institute, Ministry of Transport of the People’s Republic of China, Beijing 100088; 3. Institute of Water Problems, Hydropower and Ecology of the National Academy of Sciences of Tajikistan, Dushanbe 734042; † Corresponding author, E-mail: xiesg@pku.edu.cn

Abstract Using water-sediment microcosms and 16S rRNA and 18S rRNA sequencing analyses, phenanthrene (PHE) was selected as a representative compound of PAHs to explore its effects on water quality, as well as on the diversity, structure, and function of sediment microbial communities. The results indicated that PHE pollution affected both the magnitude and stability of water quality parameters. PHE was predominantly adsorbed onto the sediment, with a degradation efficiency of 99% observed on day 56 in the PHE treatment group. Significant differences were found in bacterial communities (RANOSIM = 0.293, P = 0.002) and fungal communities (RANOSIM = 0.147, P = 0.031) among different treatment groups. The relative abundance of many bacteria, archaea, and fungi associated with PHE degradation was higher in the PHE treatment groups than that in the control group. Compared with the control and low-dosage (PHE(L)) groups, microbial networks in the medium-dosage (PHE(M)) and high-dosage (PHE(H)) groups exhibited higher average clustering coefficients and positive correlations. Functional processes such as carbon fixation, nitrogen metabolism, and sulfur metabolism had lower relative abundance in the later incubation stages in the PHE(M) and PHE(H) groups, while methane metabolism had higher relative abundance. pH was identified as the key factor influencing the structures and functions of bacterial, archaeal, and fungal communities, followed by NH4+-N.

Key words polycyclic aromatic hydrocarbons; phenanthrene pollution; sediment; microbial community and func-tion; co-occurrence network

国家重点研发计划政府间国际科技创新合作项目(2023YFE0102400)资助