温度–淹水复合胁迫对红树植物白骨壤根际细菌群落结构多样性的影响

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 61, No. 4 (July 2025)

深圳市可持续发展专项(KCXFZ2021020165000001)和广东省普通高校创新团队项目(2023KCXTD050)资助

1.北京大学深圳研究生院, 环境与能源学院, 深圳 518055; 2.广东省红树林工程技术研究中心, 深圳 518055; †通信作者, E-mail: liruili@pkusz.edu.cn

摘要为了了解气候变化对红树植物根际微生态系统的影响, 开展红树植物白骨壤(Avicennia marina)的控制实验, 模拟昼夜温度(对照组 28/25°C, 极端低温处理 8/5°C, 极端高温处理 40/37℃)和淹水时间(对照组 10h/d, 短淹水处理 5h/d, 长淹水处理 15h/d)的复合胁迫生境, 探究根际细菌群落多样性, 组成特征和群落结构对温度–淹水复合胁迫的响应规律。结果表明, 温度和淹水胁迫均降低根际细菌多样性, 其中极端高温胁迫降低Chao1 指数(从 2367.6 降为 2017.5)和 Shannon 指数(从 2.40 降为 2.11)。主坐标分析(PCoA)结果表明, 温度对白骨壤根际细菌群落组成的影响起主要作用。短淹水胁迫下的 γ-变形菌纲的相对丰度为 19%, 低于对照组的37%。温度和淹水胁迫显著地降低假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度, 极端高温与短、长淹水的复合胁迫增加盖丝藻属(Geitlerinema)的相对丰度。与淹水相比, 温度对白骨壤根际群落结构影响更大, 并且温度与淹水之间存在一定的拮抗作用, 其复合胁迫使根际细菌群落的相互作用模式由协作关系转向竞争关系。

关键词 红树林; 温度; 淹水时间; 根际细菌多样性; 气候变化

红树林是分布于热带和亚热带海岸潮间带的木本植物群落, 具备储碳、保护生物多样性、消浪护堤、蓄水和净化水体等重要的生态服务功能[1–3]。在当前全球气候变化的背景下, 红树林在调节气候变化中发挥着不可替代的作用[4]。红树林是对全球气候变化最敏感的生态系统之一[2,5], 尤其是温度变化与海平面上升的威胁[6]。研究表明, 温度是限制红树林向两极扩张的关键因子[7], 而全球气候变暖给红树林向两极扩张提供了机会[8]。但是, 极端天气事件频发也加剧红树林的损失[9], 例如持续的高温干旱是红树林死亡的主要原因[10], 极端寒潮使红树林大面积损伤[11]。另外, 海平面与地表沉积速率的变化也影响红树林的生长[12]。各地区红树林的地表沉积速率和潮差不同, 当地表高程增加速率小于海平面上升速率时, 红树植物将长期处于淹水状态[13]; 当地表高程增加速率大于海平面上升速率时, 红树林淹水时间将变短, 红树林趋于陆地化[14]。因此, 淹水时间对红树林的建立和生存起着决定性的控制作用[15–16]。

根际微生物是促进红树林生态系统生产力的主要生物组分, 大量高度多样化的细菌群落介导着红树林沉积物中大部分能量流动和物质循环[17–19]。红树林根际丰富的微生物群落对维持红树林生态系统功能至关重要。作为阻滞陆地污染源进入海洋的重要防线, 红树林根际微生物在重金属、有机污染物和微塑料的生物降解和修复中发挥着不可替代的作用[20–22], 同时根际微生物对红树林生境的变化非常敏感, 具有较强的指示作用[23]。在中国、马来西亚和印度等国家, 变形菌门(Proteobacteria)为红树林沉积物中细菌的优势类群, 其余常见优势细菌类群包括绿弯菌门(Chloroflexi), 酸杆菌门(Acidobac-teria)和拟杆菌门(Bacter-oidetes)等[24–26]。在中国典型红树林中, 沉积物微生物 Shannon 指数为 9.17～ 10.34, Chao1 指数为 1990～2527[27–28], 表明微生物群落多样性较高。另一方面, 随着淹水时间、海水盐度、营养状况和污染状态等不同, 红树林沉积物微生物群落多样性和优势菌门相对丰度有所差异[23]。淹水时间显著地改变红树林根际细菌群落结构, 高潮带的细菌群落与中、低潮带的差异较大, 且主要功能菌群在不同潮间带的分布格局也不同[29]。另外, 红树林沉积物中大部分菌门丰富度与温度呈显著的负相关关系[30]。

红树植物根际微生态系统对外界环境变化响应敏感, 全球气候变化能够直接或间接地影响根际微生态系统[31]。红树植物白骨壤(Avicennia marina)跨纬度分布广泛, 且比其他红树植物占据更多的中低潮生境, 是探究温度–淹水复合胁迫影响的理想模式植物[32]。当前, 结合全球气候变化背景探究单一温度或淹水胁迫对红树植物根际细菌群落的影响研究不足, 且根际细菌群落组成与结构对温度–淹水复合胁迫的响应规律尚不明确。本研究开展白骨壤幼苗沙培控制实验, 模拟不同温度和淹水时间的复合胁迫生境, 揭示其根际细菌群落多样性、组成特征和群落结构对温度–淹水复合胁迫的响应规律, 为红树林应对全球气候变化的可持续发展和保育管理工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料选择红树植物白骨壤(A. marina), 它跨纬度分布方泛, 是最耐淹和耐盐的先锋真红树植物之一[33–34]。实验所用白骨壤购自广东江门, 选取11 月龄、叶片数和高度基本上一致的白骨壤幼苗作为实验对象。

1.2 实验设计

实验开始前, 对白骨壤幼苗进行沙培, 并置于室外塑料棚下, 适应培养两周, 随后在 TPG-6000 大型植物生长室内适应培养一周。生长箱环境参数设置: 昼夜温度为 28℃(白天)、25℃(夜间), 光照周期为 12L:12D, 光合有效辐射为 1000μmol/(m2·s), 相对湿度为 70%[34]。

实验胁迫处理时长为 5 天。设置 9 个处理组(表1), 每个处理组有 12 株幼苗作为平行样, 并将同一处理组的幼苗连同 PP 树脂塑料桶置于一个亚克力水缸装置中, 在亚克力水缸中加入盐度为 20‰的人工配置海水(白骨壤是专性盐生植物, 其最适生长盐度范围是 17.5‰～26.3‰[35])。通过定期补充淡水来弥补植物蒸腾和水分蒸发的损失, 始终保持水位高出培养沙 2～3cm。设置 3 个温度处理: 对照温度处理(昼夜 28/25℃)、极端低温处理(昼夜 8/5℃)和极端高温处理(昼夜 40/37℃), 温度梯度设置主要根据野外红树生长最适温度以及文献[36–38]确定。设置 3 个淹水时间: 对照淹水处理(10h/d)、短淹水处理(5h/d)和长淹水处理(15h/d), 淹水时间梯度设置主要根据野外条件下白骨壤的淹水时间以及文献[34,39]确定。

1.3 研究方法

在胁迫处理的第 5 天, 从各处理组中随机选取3 株白骨壤幼苗, 使用不锈钢铲采集幼苗根系周围沉积物。将幼苗的非根际沉积物抖落后, 采集附着于根系的沉积物[40]。将同一处理组的根际沉积物等量混合并均质处理后, 储存于 DNA-free 离心管内, 置于−80℃冰箱中保存。

对不同处理组的白骨壤根际沉积物样品进行DNA 提取。提取后, 利用 Thermo NanoDrop One 检测 DNA 的纯度和浓度。送至广东美格基因公司进行 PCR 扩增, 使用 TaKaRa Premix Taq® Version 2.0及引物对 338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)靶向扩增 16S rRNA 基因的 V3～V4 区域[41]。反应体系为 25μL 2×Premix Taq, 1μL Primer-F (10 μM), 1μL Primer-R (10 μM), 50ng DNA, 50μL Nuclease-free water。反应条件: 94℃预热 5min; 94℃变性 30s, 52℃退火30s, 72℃延伸 30s, 共循环 30 次; 72℃保持 10min; 4℃终止。最后采用高通量测序技术, 基于 Illumina Nova 6000 测序平台, 构建扩增子文库, 开展 PE250测序, 研究不同温度和淹水时间处理下根际沉积物细菌群落的多样性和结构的变化规律。

1.4 数据处理与分析方法

1.4.1 OTU聚类及物种群落组成分析

使用 usearch 软件(V8.0.1517), 按照 97%的相似性对非重复序列进行 OTU 聚类。同时选取细菌 16S rRNA 代表性序列与 SILVA 和 UNITE 数据库进行比对[42], 获取物种注释信息, 并在门、纲、属分类水平上统计每个样品的群落组成。

1.4.2 Alpha 与 Beta 多样性分析

基于 OTU丰度数据, 进行单样品的α-多样性指数分析, 计算 Chao1 丰富度指数和 Shannon-Wiener多样性指数, 计算公式[43]为

式中, SChao1 代表估计的 OTU 数目, Sobs 代表实际测量的 OTU 数目, n1 代表只含有一条序列的 OTU 数目, n2 代表只含有两条序列的 OTU 数目;

式中, HShannon 代表 Shannon 指数, ni 代表含有 i 条序列的 OTU 数目, N 代表所有的序列数。

同时, 基于均一化的 OTU 丰度表, 进行 β-多样性距离的 Bray-Curtis 计算。基于 Bray-Curtis 距离矩阵, 结合 PCoA 聚类分析方法[42], 描述不同处理组白骨壤根际沉积物样本细菌群落的差异。

1.4.3 环境因子 CCA 分析

基于 OTU丰度表和相关环境因子数据, 先利用R 软件进行去趋势对应分析, 再根据梯度值, 确定使用单峰模型(CCA)进行绘图。

1.4.4 共现性网络分析

利用 R 语言软件分析不同处理组根际沉积物细菌门水平的 OTU 丰度矩阵, 并计算 Spearman 相关系数。

2 结果与分析

2.1 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落多样性的影响

不同处理下白骨壤根际细菌群落的 α 多样性计算结果见表 2。结果显示, 对照组(CT-10h)的 Chao1指数和 Shannon 指数分别为 2367.6 和 2.40, 在所有处理组中处于较高水平。温度–淹水复合胁迫显著改变白骨壤根际细菌群落α 多样性(p<0.01), 复合处理组与单一极端低温处理组(LT-10h)比较, 极端低温+短淹水处理组的 Chao1 指数和 Shannon 指数进一步下降, 极端低温+长淹水处理组的 Chao1 指数无明显变化, 但 Shannon 指数有所升高。与单一极端高温处理组(HT-10h)比较, 复合处理组的 Chao1指数和 Shannon 指数均有所升高。与对照组(CT-10h)相比, 极端低温处理(LT-10h)降低根际细菌群落的 Chao1 指数(从 2367.6 降为 2363.3)和 Shannon指数(从 2.40 降为 2.39); 极端高温处理(HT-10h)降低 Chao1 指数(从 2367.6 降为 2017.5)和 Shannon 指数(从 2.40 降为 2.11)。与对照组(CT-10h)相比, 短淹水处理(CT-5h)降低 Chao1 指数(从 2367.6 降为2194.2)和 Shannon 指数(从 2.40 降为 2.16); 长淹水处理(CT-15h)降低 Chao1 指数(从 2367.6 降为 2203.5)和 Shannon 指数(从 2.40 降为 2.26)。因此, 与对照组相比, 温度和淹水处理均降低白骨壤根际细菌群落的多样性, 并且高温和短淹水的作用更强。

利用主坐标分析(PCoA)方法, 对不同处理组白骨壤根际细菌群落组成差异进行比较, 结果见图 1。采用 Bray-Curtis 作为距离计算方法, 处理组之间相距越近, 则细菌群落的主要物种组成越相似, 相距越远, 则细菌群落的主要物种组成差异越大。结果表明, 不同处理下真红树植物白骨壤根际细菌群落 β 多样性基于温度的分区聚合明显, 分为 3 组: 1)对照温度处理组(CT-5h, CT-10h, CT-15h); 2)极端低温处理组(LT-5h, LT-10h, LT-15h); 3)极端高温处理组(HT-5h, HT-10h, HT-15h)。因此, 不同温度处理对白骨壤根际细菌群落组成的影响更明显, 而不同淹水处理对根际细菌群落组成的影响较小, 说明在温度–淹水复合胁迫下, 温度对白骨壤根际细菌群落组成的影响起主要作用。

2.2 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落组成的影响

白骨壤根际细菌群落组成相对丰度大于 0.01%的前 15 个细菌门如下: 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacter-ia)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、绿弯菌门(Chlo-roflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Ac-tinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrob-ia)、浮霉菌门(Planctomycetes)、硝化螺旋菌门(Ni-trospirae)、Dependentiae 菌门、装甲菌门(Armati-monadetes)和衣原体门(Chlamydiae)(图 2(a))。其中, 相对丰度排名前两位的变形菌门和拟杆菌门的平均相对丰度分别为 49.7%和 19.8%, 约占整个细菌群落丰度的 70%, 相对丰度排名前 1/2 的菌门占整个细菌群落丰度的 95%以上。

在白骨壤根际沉积物的细菌群落中筛选出相对丰度大于 0.01%的前 25 个细菌纲, 进行进一步分析, 结果见图 2(b)。γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)以及 δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)的平均相对丰度分别为 30.7%, 18.3%和 2.7%, 共同组成门水平下相对丰度最高的变形菌门。对照组(CT-10h)中 γ-变形菌纲的相对丰度为 37%, 单一温度(10h/d淹水)或淹水胁迫(CT)均降低 γ-变形菌纲的相对丰度(19%～33%), 极端高温+短或长淹水胁迫使 γ-变形菌纲的相对丰度分别减少至 32%和 25%, 但极端低温+短或长淹水胁迫无显著变化。与对照组(CT-10h)相比, 短淹水胁迫(CT-5h)降低 γ-变形菌纲的相对丰度(37%降为 19%)。与单一温度胁迫相同, 极端高温+短或长淹水胁迫使得 Parcubacteria 和 Rhodothermia 的相对丰度大幅度增加。

在白骨壤根际沉积物的细菌群落中筛选出相对丰度大于 0.01%的前 25 个细菌属(图 2(c))。其中, 无任何分类信息菌属(Unassigned)和不可培养菌属(Uncultured)的平均占比分别是 46%和 10.6%。与单一淹水胁迫(CT)比较, 极端低温和高温胁迫使假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度进一步下降, 指示根际沉积物环境中可供假单胞菌属生长利用的营养物质含量减少。同时在极端高温+长淹水胁迫下盖丝藻属(Geitlerinema)相对丰度显著上升(15%)。

2.3 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落结构的影响

为深入探究温度和淹水对白骨壤根际细菌群落结构的影响, 采用典范对应分析(canonical corres-pondence analysis, CCA)方法揭示不同处理组白骨壤根际细菌群落结构与环境因子的关系。图 3 显示, 横轴(CCA1)和纵轴(CCA2)分别解释细菌群落结构58.4%和 41.4%的变化, 总解释率高达 99.8%, 表明在本研究中温度和淹水两个环境因子足以解释绝大部分的环境影响。图 3 中射线的长度表示该环境因子与样本的相关程度, 温度的射线长度大于淹水时间环境因子, 表明温度与白骨壤根际细菌群落结构的相关性最高, 即复合胁迫下温度的影响起主要作用。另外, 温度与淹水时间两个环境因子之间呈负相关关系, 即二者存在拮抗作用。

2.4 温度–淹水胁迫下根际细菌群落的共线性网络

为深入探究白骨壤根际细菌群落之间的相互作用关系, 应用 Spearman 相关系数计算细菌物种的相关性, 并运用网络分析法探究不同处理组细菌群落的共现模式(图 4)。与对照组(CT-10h)相比, 低温和高温胁迫下的网络联系数均有所增加; 短时和长时淹水胁迫下的网络连线数均增加。结果显示, 与单一温度胁迫(10h/d淹水)相比, 低温–短淹水、高温–短淹水、高温–长淹水复合胁迫下网络正相关占比进一步降低, 说明复合胁迫下菌群的相互作用趋于从“协作”关系向“竞争”关系变化。与单一淹水胁迫(CT)相比, 复合胁迫下的网络连线数和正相关比例均进一步下降, 证明复合胁迫下细菌群落规模减小, 且菌群之间的竞争或捕食关系越发加剧。从总体上看, 相较于单一胁迫, 温度–淹水复合胁迫使菌群之间对营养物质的竞争更加激烈。

3 讨论

3.1 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落多样性的影响

本研究发现, 与单一淹水处理组比较, 淹水与极端低温复合胁迫下白骨壤根际细菌群落多样性升高(图 1)。已有研究表明墨西哥拉巴斯红树林表层沉积物细菌丰度和多样性在温度较低的季节高于炎热季节[44], 因此低温对白骨壤淹水胁迫下根际细菌群落多样性的下降有一定的抵消和弥补作用。与单一极端高温胁迫比较, 极端高温+短或长淹水胁迫下的根际细菌群落多样性均有所升高(表 2), 说明短淹水与长淹水对高温胁迫下红树林根际细菌群落多样性的下降也有抵消作用。在低温胁迫下, 复合的淹水胁迫则使白骨壤根际细菌群落多样性进一步下降(表 2)。这可能是由不同胁迫条件之间存在交互作用, 细菌对特定胁迫条件的敏感度与耐受性不同引起的[45], 有待进一步研究。

3.2 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落组成的影响

本研究中, 白骨壤根际细菌群落组成优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroide-tes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、髌骨细菌门(Pate-scibacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)(图 2)。变形菌门(Proteobacteria)是东南亚及中国红树林沉积物中丰富度最高的优势菌门[24]。在中国漳江口红树林沉积物中, 优势菌门除变形菌门(Proteobacteria)外, 还包括蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actino-bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacte-roidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)[46]。有研究表明北部湾红树林沉积物中变形菌门(Proteobacteria)的丰度与温度不存在显著的相关性, 可能是由于温度范围的不同导致[30]。与单一温度胁迫相同, 极端高温+短或长淹水胁迫使 Parcubacteria 和 Rhodother-mia 两种菌纲的相对丰度明显增加(图 2)。Parcubac-teria 隶属髌骨细菌门(Patescibacteria), 比其他细菌少了多余的代谢路径、细胞活动和应激反应[47–48], 因此在极端高温环境下应对沉积物缺氧或厌氧(高温)、营养匮乏(沙培)的逆境中更具备生存优势。Rhodothermia 是典型嗜热菌, 分布在含一定盐度的环境中[49], 在极端高温处理组中普遍占比更高。

此外, 极端高温+短或长淹水胁迫相比单一淹水胁迫, 假单胞菌属的相对丰度进一步下降, 指示根际沉积物环境中可供假单胞菌属生长利用的营养物质含量减少。盖丝藻属(Geitlerinema)属于蓝细菌门, 其相对丰度在极端高温+长淹水胁迫下显著上升(占 15%), 推测高温高湿环境更有利于盖丝藻属的生长, 与大多数藻类菌适宜生长的生境相同[50]; 但盖丝藻属被证实能产生剧毒石房蛤毒素[51], 因此高丰度的盖丝藻属可能对白骨壤根际细菌群落生长产生不利影响。

3.3 温度–淹水复合胁迫对白骨壤根际细菌群落结构的影响

本研究中, 温度与白骨壤根际群落结构相关性高于淹水时间, 且温度与淹水时间之间存在一定拮抗作用(图 3)。已有研究表明, 温度是影响红树林生长的主要因素[52], 而红树林根分泌物是其根际细菌群落组合与结构的决定因素[53], 因此温度显著影响红树植物根际细菌群落的结构特征。另外, 相较于对照组, 温度胁迫下细菌群落交互均有所增加, 说明极端温度胁迫扩大了根际细菌群落规模, 交互复杂程度更高[54]。极端低温胁迫下细菌间正相关作用比例增加, 表明菌群之间趋于协作和共生关系; 极端高温胁迫下的网络正相关比例明显下降, 说明菌群之间的竞争更强。短淹水胁迫下细菌群落共现网络正相关比例下降, 而长淹水胁迫下的网络正相关比例升高, 表明短淹水胁迫加剧菌群之间的竞争关系, 长淹水胁迫则使菌群之间的协同合作关系更密切。

4 结论

1)红树植物白骨壤的根际细菌多样性在温度和淹水胁迫下降低, 其中极端高温胁迫使 Chao1 指数从 2367.6 降为 2017.5, Shannon 指数从 2.40 降为2.11。

2)红树植物白骨壤根际细菌中 γ-变形菌纲的相对丰度在短淹水胁迫下为 19%。假单胞菌属的相对丰度在温度和淹水胁迫下降低, 盖丝藻属的相对丰度在极端高温+短或长淹水胁迫下呈现增长趋势。

3)温度与白骨壤根际群落结构的相关性高于淹水时间, 且温度与淹水时间之间存在拮抗作用。温度–淹水复合胁迫使根际细菌群落的相互作用模式由协作关系转向竞争关系。

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Impact of Combined Temperature-Inundation Stress on Rhizosphere Bacterial Communities Diversity in the Mangrove Plant Avicennia marina

1. School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; 2. Guangdong Mangrove Engineering Technology Research Center, Shenzhen 518055; †Corresponding author, E-mail: liruili@pkusz.edu.cn

Abstract To understand the impact of climate change on the rhizosphere microecosystems of mangrove plants, this study conducted controlled experiments on the mangrove plant Avicennia marina, in which combined stress was simulated with day/night temperature (control: 28/25°C; extreme low temperature: 8/5°C; extreme high temperature: 40/37°C) and inundation duration (control: 10 h/d; short inundation: 5 h/d; long inundation: 15 h/d). The aim was to explore the response of rhizosphere bacterial diversity, composition, and structure to combined temperature-inundation stress. The results showed that temperature and inundation stress reduced the diversity of rhizosphere bacteria, and extreme high temperature reduced the Chao1 index from 2367.6 to 2017.5 and the Shannon index from 2.40 to 2.11. Principal coordinates analysis revealed that temperature played a primary role in influencing the composition of the rhizosphere bacterial communities in A. marina. Under short inundation, the relative abundance of Gammaproteobacteriawas 19%, lower than that of the control group (37%). Temperature and inundation stress significantly reduced the relative abundance of Pseudomonas, while extreme high temperature combined with short or long inundation increased the relative abundance of Geitlerinema. Additionally, compared with inundation, temperature had a greater impact on the rhizosphere community structure of A. marina, and an antagonistic effect existed between temperature and inundation, shifting the rhizosphere bacterial communities from cooperative to competitive interactions.

Key words mangrove; temperature; inundation time; rhizosphere bacterial community diversity; climate change