(a)～(c)为日本晴空白组水稻幼苗生长情况, 其中(a)为正常生长, (b)为低温胁迫, (c)为复性; (d)～(f)为实验组水稻幼苗生长情况, 其中(d)为正常生长, (e)为低温胁迫, (f)为复性
图1 水稻幼苗生长情况
Fig. 1 Growth of rice seedlings
北京大学学报(自然科学版) 第61卷 第1期 2025年1月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 61, No. 1 (Jan. 2025)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2024.082
辽宁省高等学校基本科研项目(LJKMZ20220894)资助
收稿日期: 2023–12–28;
修回日期: 2024–04–22
摘要 选取日本晴水稻作为研究对象, 模拟水稻幼苗从正常生长到遭遇低温再到复性的全过程, 结合水稻幼苗生理生化指标的测定结果, 发现施加褐藻胶寡糖不仅提高水稻幼苗抵御低温胁迫的能力, 还提高其 SOD, POD和 CAT 活性以及根系活力; 同时, 在水稻幼苗受到低温胁迫时, 褐藻胶寡糖能促进其产生更多的可溶性糖, 并有效地抑制丙二醛含量的增加。采用非标记定量技术, 对差异蛋白和差异代谢物进行鉴定和分析, 并研究其代谢通路。差异表达蛋白进行 GO 注释后, 实验组富集到的条目更多; 通过 KEGG 富集得到前 10 条关键性通路。通过 UPLC-Q-TOF-MS 对水稻幼苗进行代谢组学分析, 发现小分子差异代谢物主要为胺类, 其次为羧酸和生物碱等。研究结果阐明褐藻胶寡糖提高水稻幼苗抗寒性能的机理, 可为理解水稻幼苗抗寒性能防御机制及褐藻胶寡糖的研发利用提供科学依据。
关键词 水稻幼苗; 褐藻胶寡糖; 抗寒性能; 蛋白质组学; 代谢组学
水稻是重要的粮食作物, 世界上超过一半的人口以水稻作为主要营养来源。水稻的生长需要比较高的温度, 水稻种子萌发的标准温度约为 30°C, 低于 20°C 会导致水稻萌发率下降[1]。低温是水稻栽培中主要的非生物胁迫之一[2], 低温胁迫延缓水稻的萌发和出苗, 减少叶绿素合成[3], 破坏植物细胞膜, 降低酶活性[4]。同时, 在冷胁迫下, 抗氧化剂种类的含量也会增加[5]。在提高耐寒性的叶片组织中发现低温保护的可溶性糖[6]以及包括酶类抗氧化剂在内的保护系统[7], 如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT), 它们广泛分布于植物中, 通过调节活性氧水平来应对非生物胁迫, 特别是冷害[8]。耐冷性是一个受多基因控制、受环境影响的复杂性状, 因此水稻耐冷性遗传基础的研究进展相对缓慢[9]。
褐藻胶在自然界中含量丰富, 可作为新型的植物生长调节剂, 在众多领域发挥作用[10]。褐藻胶寡糖(AOS)是由褐藻胶裂解酶催化褐藻胶解聚制备的海洋寡聚物[11]。AOS 具有潜在的生物技术应用价值, 能有效地保护植物中蛋白质和细胞膜免受各种胁迫条件引起的失活或变性[12], 同时具有多种生物活性, 如抑制细菌生长[13]、提升抗氧化性能[14]、促进植物生长发育[15]和改善植物抗逆性[16]等, 其开发与利用已成为海洋资源高值化应用的发展趋势。
蛋白质组学包括蛋白质组中所有蛋白质成分的识别和量化[17], 从定性和定量两个层面进行研究, 是探究蛋白质基因组编码的蛋白质化学成分和变化规律的一门现代科学技术[18]。相对于基因组学, 蛋白质组学的优势体现在规模大、通量高和覆盖面 全[19]。蛋白质组学为植物相关指标的定量化诊断提供基础[20], 并对通过应用蛋白质生物学功能的研究来提高作物耐寒性的分子育种策略具有重要的意 义[21]。
代谢组学是近年来随着基因组学和转录组学等组学技术的发展而迅速崛起的领域, 这些技术可以系统地检测和量化生物或生物体液样品中的内源性小分子代谢物[22–24]。代谢组学数据提供许多关于控制植物生长和发育的代谢物[25]、植物激素和转录网络信息[26]。代谢组学技术的不断发展有助于定性和定量鉴定复杂的或新样品中新型代谢物, 并为未来新代谢物的开发和应用提供可能性[5]。
本研究选用日本晴水稻为实验材料, 直观地对比褐藻胶寡糖处理后水稻幼苗在正常生长、低温胁迫和复性 3 个阶段生理生化指标的差异, 同时结合蛋白质组学和代谢组学, 阐明褐藻胶寡糖对水稻幼苗低温响应的诱导机制, 以期深入地理解水稻抗寒性能防御机制, 并为新型植物生长调节剂的研发利用提供科学依据。
实验仪器主要有 GZP-450s 程控光照培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、DGG-9140B 电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)、TECAN酶标仪(勒菲生物科技(上海)有限公司)、Spectrum-two 傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)(铂金埃尔默仪器有限公司)、Ultimate™ 3000 RSLCnano System (美国戴安公司)、QExactive™组合型四极杆 Orbitrap质谱仪(美国Thermo Fisher公司)、6545Q-TOF 液质联用仪(美国安捷伦公司)、HealForceSMART-N 超纯水处理系统(力新仪器(上海)有限公司)。
水稻品种为“山彦”与“幸风”杂交后代——日本晴(Nipponbare)粳型常规水稻。褐藻胶寡糖购自青岛海莱美生物科技有限公司, 分子量约为 2kDa。
试剂: 霍格兰通用营养液、次氯酸钠溶液、丙酮、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、胰蛋白酶(Trypsin)、甲酸(上海 Sigma-Aldrich 公司)、乙腈(德国默克公司)、甲醇(德国默克公司)。
1.3.1 水稻幼苗的低温处理
前处理: 取一定数量的种子, 用 3%的次氯酸钠进行灭菌, 搅拌 5 分钟, 反复两次; 用去离子水搅拌 5 分钟, 反复 2 次; 将清理后的种子用去离子水及 0.5%褐藻胶寡糖溶液浸透 24 小时后, 再用蒸馏水洗净。
正常生长: 将 140 粒左右的种子均匀地铺在托盘上, 用滤纸淋湿, 然后把它们放在有水的托盘里。在温度为 28℃, 相对湿度为 75%的恒温培养箱中进行避光萌发。萌芽后取下滤纸, 用稀释至 1/4浓度的霍格兰普通营养液代替去离子水, 并将培养条件更改为 28℃, 光照黑暗各 12 小时; 长到一叶期后, 两天更换一次稀释至 1/2 浓度的霍格兰通用营养液。3 天后换成全营养液至三叶期。
低温处理: 7 天, 15℃, 湿度 75%, 光照黑暗各12 小时; 两天更换一次营养液。
复性: 7 天, 28℃, 湿度 75%, 光照黑暗各 12 小时; 两天更换一次营养液。
1.3.2 水稻幼苗生理生化测定
用 80%丙酮提取叶绿素, 测定 645nm 及 663nm波长下吸光值, 计算叶绿素含量。参考 Song 等[27]的方法测定可溶性糖含量。参考 Meng 等[28]的方法测定丙二醛含量。根系活力的测定用 TCC(红四氮唑)法, 测定 485nm 波长下吸光度值, 计算根系活力。SOD, POD 和 CAT 的测定方法分别参考文献[29], [30]和[8]。
1.3.3 LC-MS/MS分析
1)色谱条件。预柱为 C18PepMap100(5μm, 100Å), 分析柱为 Acclaim PepMapTMRSLC(75μm×15cm, 3μm); 流动相 A 为 0.1%甲酸水, 流动相 B 为0.1%甲酸水和 80%乙腈; 流速为 0.3μL/min, 预柱温度为 45℃, 进样量为 1μL。
2)质谱条件。通过纳升级电喷雾对样品进行离子化, 经 Q Exactive™组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪进行质谱分析。质谱扫描方式为正离子模式, Full MS/dd-MS2。一级质谱参数: Orbitrap 分辨率为70000, AGC 目标为 3e6, 最大注入时间为 100ms, 扫描范围(m/z)为 350～1800。二级质谱参数: Orbitrap分辨率为 35000, AGC 目标为 1e5, 最大注入时间为110ms, 母离子个数为 15, 碰撞能量为 27%, 固定第一质量(m/z)为 110; 隔离窗(m/z)为 2; 光谱数据类型选择质心模式。
3)数据库检索。本研究分析水稻 3 个不同时间点的肽段样品, 每种样品均重复 3 次。对质谱输出的原始 RAW 文件数据, 采用 Proteome Discoverer (2.2.0.388)软件进行搜库, 得到蛋白鉴定数目。胰蛋白酶为唯一裂解酶, 最多有 2 个漏切位点。前体离子的质量偏差为 10–5, 碎片离子的质量偏差允许±0.02Da。使用 LFQ (label-free quantitative)方法, 对得到的蛋白结果进行定量蛋白组学分析。本实验使用水稻总数据库(Oryza sativa L., 1303332 个序列), 数据库来源于 Uniprot。
1.3.4 非标记定量蛋白组学分析
为了使结果更具有统计学意义, 按照变异系数CV<20%对 LFQ 结果进行筛选, 得到稳定表达的蛋白质。本次实验选择 3 种比较方式来研究其中存在的差异表达蛋白, 分别为低温胁迫对比正常生长、复性对比正常生长、复性对比低温胁迫。相对变化倍数≥1.2 (CV<20%)为上调蛋白; 相对变化倍数≤0.8 (CV< 20%)为下调蛋白。
1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS分析
1)色谱条件。①正离子模式。色谱柱为 Agi-lent Eclipse Plus C18 (2.1mm ×100mm, 1.8μm), 柱温 40℃, 进样量为 10μL, 流速为 0.3μL/min; 流动相 A 为 0.1%甲酸水, 流动相 B 为 0.1%甲酸–乙腈。梯度洗脱条件: 0～2min, 95%流动相 A+5%流动相 B; 20～25min, 100%流动相 B。②负离子模式。色谱柱为 Agilent Eclipse Plus C18 (2.1mm×100mm, 1.8μm), 柱温 40℃, 进样量为 10μL, 流速为 0.3μL/min; 流动相 A 为 1mM 氟化铵, 流动相 B 为 100%乙腈。梯度洗脱条件: 0～2min, 95%流动相 A+5%流动相 B; 20～25min, 100%流动相 B。
2)质谱条件。①正离子模式: 离子源为电喷雾, 电离模式为正离子模式(ESI+), 干燥气流速为 7L/min, 干燥气体温度为 325℃, 雾化器流速为 35psi, 鞘气流速为 11L/min, 鞘气温度为 350℃, 毛细管电压为 3.5KV, 喷嘴电压为 0KV, 扫描范围(m/z)
为 50～1700, 参比离子(m/z)为 121.0509, 922.0098。
②负离子模式: 离子源为电喷雾; 电离模式为正离子模式(ESI–); 干燥气流速为 7L/min; 干燥气体温度为 325℃; 雾化器流速为 35psi; 鞘气流速为 11L/min; 鞘气温度为 350℃; 毛细管电压为 3.0kV, 喷嘴电压为 0kV; 扫描范围(m/z)为 50～1700; 参比离子(m/z)为 112.9855 和 1033.9881。
3)质控样本。为了考察分析样本的重复性, 并评估 6545Q-TOF 的仪器稳定性, 将 12 种不同的水稻叶片代谢提取物充分混合(前处理方法同分析样本), 制备成质控样本(QC)。监测方式为在测试分析样本之前先进 5 针 QC, 在每个分析样本 5 次重复后插入一个 QC, 分析样本结束后再进 5 针 QC。
4)数据库检索。用 MassHunter ProfinderB.8.0软件对质谱所得的原始数据进行特征提取(保留时间对齐、降噪等), 将提取后的数据用 Mass Profiler Professional B 14.9.1 进行分组以及对库。数据库为 Metlin_Metabolites_AM_PCDL.cdb, 来源于 Mass-Hunter MPP8.0。
5)差异代谢物的筛选标准。对得到的每种样品的 5 次重复数据进行归一化处理和缺失值补充, 得到稳定存在的代谢物, 使结果更具有统计学意义。将数据分为 3 组(低温胁迫和正常生长、复性和正常生长、复性和低温胁迫), 采用偏最小二乘判别分析 PLS-DA, 按照 VIP 值>1 的筛选标准, 对组间差异代谢物进行筛选。
6)差异代谢物的鉴定。对得到的所有小分子代谢物进行代谢物类别划分, 将目标小分子差异代谢物的分组数据导入 SIMCA14.1, 进行主成分分析和偏最小二乘判别分析。利用在线分析平台 KEGG Mapper Search(https://www.kegg.jp/kegg/mapper/se arch.html), 对差异代谢物进行差异小分子代谢物代谢通路分析。
2.1.1 褐藻胶寡糖对水稻幼苗抗寒生理指标的影响
图 1 展示水稻幼苗正常情况下生长、低温处理 7天和复性 7 天 3 个时间点的生长情况。日本晴水稻幼苗茎叶较为细长, 从低温胁迫开始, 空白组水稻就开始出现倒伏, 复性阶段空白组倒伏情况明显; 低温时实验组的水稻并没有出现倒伏, 直至复性阶段仍然保持良好长势。实验组的幼苗在遇到低温后, 水稻恢复能力很强, 幼苗挺拔, 茎部较粗, 叶片颜色不仅没有变黄, 颜色甚至更绿。可以看出, 褐藻胶寡糖在帮助水稻幼苗抵御寒冷方面起到一定的作用。
表 1 为水稻幼苗各个部分的长度测量结果以及根、茎、叶 3 个部分的鲜重和干重(10 株为一个单位)。可以看出, 无论是实验组还是空白组, 根茎叶数值均随着时间的推移逐渐增大, 实验组在正常培养阶段就比空白组高大, 说明加入褐藻胶寡糖可以刺激水稻幼苗的生长。其中茎部分, 实验组的鲜重在正常生长阶段较空白组提升 12.9%, 冷胁迫阶段鲜重和干重分别提升 40.0%和 14.7%, 复性阶段鲜重和干重分别提升 52.0%和 102.5%。因此, 实验组的干重和鲜重相较于空白组都有一定程度的提升, 这种现象在水稻幼苗的复性阶段尤为明显, 干重的增加表明有机物积累量的提升。据此可以推测, 加入褐藻胶寡糖使水稻幼苗的抗寒性能得到提升。
2.1.2 褐藻胶寡糖对水稻幼苗抗寒生化指标的影响
为探究褐藻胶寡糖对水稻幼苗抗寒性能的影响, 本研究测定水稻幼苗叶绿素含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、根系活力、SOD 活性、POD 活性和 CAT 活性 7 个生化指标。
叶绿素是植物体内重要的色素。植物光合作用过程中, 叶绿素从外界光中摄取能量, 供植物体生长发育[31]。水稻幼苗叶绿素含量变化情况如图 2(a)所示, 在水稻经历低温胁迫后再进行复性, 空白组叶绿素含量下降 7%, 实验组反而上升 61%, 说明褐藻胶寡糖不仅可以促进水稻在正常生长时进行叶绿素的合成, 还可以有效地提升水稻在受到冷胁迫后的恢复能力。可溶性糖的含量增加有利于降低水稻叶片细胞中细胞质溶液的凝固点, 减轻低温胁迫造成的叶片冻伤[32]。水稻幼苗可溶性糖含量变化情况如图 2(b)所示, 经过低温胁迫, 可溶性糖含量明显增加, 实验组比空白组增加近 3 倍, 加入褐藻胶寡糖后, 增强了水稻幼苗自身的这种保护机制, 胁迫结束后这种差异变小, 实验组的可溶性糖含量恢复至正常生长时的水平。在遭受逆境时, 植物体会发生膜脂过氧化, 膜脂过氧化的终产物——丙二醛不仅具有一定的细胞毒性, 而且会抑制蛋白质的合成, 丙二醛与蛋白、核酸等发生反应会导致其功能丧失[33]。水稻幼苗丙二醛含量变化情况如图 2(c)所示, 水稻幼苗 3 个时间节点的实验组丙二醛积累量均低于空白组, 说明褐藻胶寡糖处理过的水稻细胞膜受损程度较小。水稻幼苗根系活力变化情况如图2(d)所示, 3 个时间节点水稻幼苗根系活力变化趋势为先升高后下降, 且实验组始终高于空白组, 实验组根系活力全部大于空白组, 说明褐藻胶寡糖有调节水稻吸收矿物的能力, 在一定程度上帮助根系生长, 与地上部分的现象相互对应。水稻幼苗超氧化物歧化酶 SOD 变化情况如图 2(e)所示, 3 个时间点实验组 SOD 酶活性均大于空白组, 在复性阶段更加明显, 且持续增加, 说明这种改善效果具有一定的持续性。水稻幼苗过氧化物酶 POD 的变化情况如图 2(f)所示。低温处理时, 低温胁迫使得水稻中产生大量过氧化氢, 过氧化氢含量高对植物细胞有损害, 可能导致植物衰老, 而 POD 能还原过氧化氢, 从而延缓植物的衰老。在 3 个时间节点, 水稻幼苗的 POD 含量逐渐增加, 且实验组含量均大于空白组, 低温胁迫及复性后分别提高 95.15%和 69.72%。两个实验组水稻的 POD 含量大于空白组, 推测在受到胁迫时, 褐藻胶寡糖会提高 POD 的含量, 从而帮助植物体抵御胁迫。水稻幼苗过氧化氢酶 CAT 变化情况如图 2(g)所示, 在 3 个时间点, 实验组的 CAT酶活性均大于空白组, 并且在低温胁迫时更明显。
(a)～(c)为日本晴空白组水稻幼苗生长情况, 其中(a)为正常生长, (b)为低温胁迫, (c)为复性; (d)～(f)为实验组水稻幼苗生长情况, 其中(d)为正常生长, (e)为低温胁迫, (f)为复性
图1 水稻幼苗生长情况
Fig. 1 Growth of rice seedlings
表1 水稻幼苗表型参数
Table 1 Phenotypic parameters of rice seedlings
阶段组别长度/cm鲜重/g干重/g根茎叶根茎叶根茎叶 正常生长CK7.71±1.2615.69±2.508.30±1.690.273±0.0250.443±0.0310.210±0.0170.022±0.0010.182±0.0400.044±0.007 EG7.53±0.9419.56±1.648.41±1.140.30±0.0070.500±0.0610.190±0.0000.024±0.0040.164±0.0120.033±0.003 低温胁迫CK6.65±1.2517.16±1.318.98±1.270.313±0.0060.407±0.1500.187±0.0120.028±0.0010.191±0.0020.059±0.005 EG8.33±0.9719.61±1.558.66±0.900.340±0.0720.570±0.0440.200±0.0100.030±0.0060.219±0.0290.060±0.007 复性CK7.45±0.8319.54±3.7713.76±3.000.303±0.0930.513±0.3060.357±0.1080.025±0.0050.080±0.0140.097±0.009 EG8.73±0.3528.23±2.2119.46±1.550.413±0.2080.780±0.3850.490±0.2070.033±0.0080.165±0.0630.126±0.031
说明: CK 为空白组, EG 为实验组(AOS 处理), 下同。
图2 水稻幼苗生化指标
Fig. 2 Biochemical indicators of rice seedlings
本次实验检测水稻幼苗空白组与实验组 3 个时间节点(正常生长、低温胁迫和复性), 每组样品检测 3 次, 共 18 组不同的样品, 样品的蛋白鉴定数目见表 2。可以发现, 实验组蛋白鉴定数目明显大于空白组, 原因可能是褐藻胶寡糖增加了蛋白表达量, 使一些低表达蛋白容易被鉴定到。使用 LFQ(label-free quantitative)方法对鉴定得到的蛋白进行比较, 寻找差异表达蛋白(DEPs), 结果见表 3。实验组中, CvsN(低温胁迫对比正常生长)有 889 个 DEPs, 其中上调蛋白为 640, 下调蛋白为 249; RvsN (复性对比正常生长)有 1101 个 DEPs, 其中上调蛋白为 626, 下调蛋白为 475; RvsC (复性对比低温胁迫)有 1354个 DEPs, 其中上调蛋白为 682, 下调蛋白为 672。在水稻幼苗中, CvsN(低温胁迫对比正常生长)上调蛋白居多, 而 RvsC (复性对比低温胁迫)下调蛋白居多, 说明低温胁迫引起水稻内部蛋白表达量的剧烈变化。
表2 水稻质谱蛋白质鉴定数目
Table 2 Number of rice mass spectrometry protein identifications
正常生长低温胁迫复性 CKEGCKEGCKEG 359621092961243521312053 311521033356241519802062 226522114139236817112053
对于水稻幼苗 3 种不同的比较方式中产生的大量差异表达蛋白, 进行 GO 分类注释和富集分析。针对参与生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecularfunction, MF), 富集所涉及的 GO 条目, 列出排名前15 的条目, 并进行统计(图 3～5)。
图 3 为水稻幼苗的生物过程(BP)注释。水稻生物过程注释中前 15 的条目包括杂环代谢过程、有机循环化合物代谢过程、有机物质生物合成过程、有机氮化合物代谢过程、氧化还原过程、小分子代谢过程、细胞生物合成过程、细胞过程调控、细胞芳香族化合物代谢过程、细胞氮化合物代谢过程、多细胞生物发育、对有机物的反应、对无机物质的反应、对含氧化合物的反应以及大分子代谢过程。RvsN 的 15 个条目对应的实验组富集到的生物过程均大于空白组, RvsC 有 13 个条目对应的实验组富集到的生物过程大于空白组, CvsN 也有 1 个条目对应的实验组富集到的生物过程大于空白组。
表3 水稻幼苗稳定蛋白、差异表达蛋白、上调蛋白和下调蛋白的数目详细信息
Table 3 Detailed information on the number of stable proteins, differentially expressed proteins, up-regulated proteins, and downregulated pro-teins in rice seedlings
组别对比SPsDEPsUPDOWN CKCvsN13781130870260 RvsN937759585174 RvsC982592329263 EGCvsN1557889640249 RvsN15181101626475 RvsC19471354682672
说明: SPs为稳定存在蛋白, DEPs为差异表达蛋白, UP为上调蛋白, DOWN为下调蛋白。
图3 水稻幼苗生物过程注释
Fig. 3 Notes on biological processes of rice seedlings
图 4 为水稻幼苗的细胞组分(CC)注释。水稻细胞组分注释中前 15 个条目包括细胞质、细胞器内膜、细胞器的包围膜、细胞内核糖核蛋白复合物、细胞内的细胞器、细胞壁、肽酶复杂、膜整体组件、膜蛋白复合物、类囊体部分、类囊体、胞质部分、胞内细胞器腔、胞内细胞器部分和胞间连丝。RvsN 的 15 个条目对应的实验组富集到的生物过程均大于空白组, RvsC 有 11 个条目对应的实验组富集到的生物过程大于空白组。
图 5 为水稻幼苗的分子功能(MF)注释。水稻分子功能注释中前 15 个条目包括核酸结合、阳离子绑定、阴离子绑定、核苷磷酸盐结合、转移酶活性, 转移含磷基团、相同的蛋白质结合、水解酶活性(作用于酯键)、氧化还原酶活性, 作用于NAD(P)H、水解酶活性(作用于酸酐)、肽酶的活动、底物特异性跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶活性(作用于供体的 CH-OH 基团)、磷酸盐跨膜转运蛋白活性、酶结合、蛋白质结构域特异性结合。RvsC 有 8 条目对应的实验组富集到的分子功能大于空白组。
从总体上看, 本研究所针对的水稻幼苗在生物过程(BP)、细胞定位(CC)和分子功能(MF)富集到的前 15 条目在实验组和对照组大致相同, 表明这些条目与水稻的生命活动紧密相连, 并且实验组比空白组富集到的条目数更多, RvsN 和 RvsC 表达的差异蛋白尤为明显, 表明实验组可以调动更多的水稻蛋白去完成恢复过程[34]。
图4 水稻幼苗细胞组分注释
Fig. 4 Notes on cell components of rice seedlings
为了找出受褐藻胶寡糖影响的途径, 本研究用KEGG 进行通路富集分析。图 6 为水稻幼苗 DEPs富集的前 10 条关键性通路。实验组中, CvsN 有 1 条通路差异表达蛋白数目大于空白组, RvsN 有 9 条, RvsC 有 10 条; 可以发现实验组在 RvsC 和 RvsN 富集到的前 10 条关键通路中, 大多数通路的差异表达蛋白数目大于空白组, 证明褐藻胶寡糖对富集到的关键通路中的蛋白影响程度较大, 从而产生大量的差异蛋白。
根据 Uniprot 数据库的蛋白识别号(Accession号)找到的水稻幼苗在光合作用途径中产生的共同蛋白汇总于附录 1。实验组产生 27 个共同蛋白, 正常生长时有 18 个蛋白丰度高于空白组, 低温胁迫时有 17 个丰度高于空白组, 复性时有 8 个高于空白组。在水稻幼苗光合作用蛋白中, 有一部分蛋白在正常生长时丰度较高, 在低温胁迫后丰度降低, 说明光合作用相关的蛋白受到环境胁迫的调控, 当水稻植株受到寒冷胁迫时, 光合活性受到极大的抑制。与叶绿素生物合成、叶绿素 a/b 结合蛋白、PSI、PSII 和细胞色素b6f 相关的蛋白被显著下调。无论在正常生长时还是在低温胁迫时, 实验组的共同蛋白丰度均大于空白组, 说明褐藻胶寡糖会调节共同蛋白的丰度, 增强光合作用。在低温胁迫时, 光合作用相关的蛋白丰度较大, 实验组受到低温胁迫的影响较小。在低温胁迫和复性阶段, 共同蛋白的丰度大于空白组, 说明褐藻胶寡糖处理过后, 一方面增强光合作用, 另一方面遏制低温胁迫带来的影响[35]。
图5 水稻幼苗分子功能注释
Fig. 5 Molecular functional annotation of rice seedlings
根据蛋白识别号(Accession 号)找到的水稻光合作用途径中的差异蛋白结果汇总于附录 2。实验组共 25 个差异蛋白, 其中 CvsN 为 12 个: 光系统Ⅱ差异表达 PsbB, PsbC, PsbD, PsbF 和 PsbO, 光系统 I 差异表达 PsaA, PsaB, PsaH 和 PsaK; RvsN 为 13 个: 光系统Ⅱ差异表达 PsbA, PsbE, Psb28 和 PsbH, 光系统I 差异表达 PsaC, PsaD 和 PsaE, 细胞色素 b6f 差异表达 PetF。
本实验主要研究光合作用的第二部分反应电子转移和光合磷酸化, 根据 KEGG 的富集结果可以发现, 褐藻胶寡糖处理过的水稻在受到低温胁迫时可以提高光合作用相关蛋白丰度, 促使更多光合作用相关的蛋白被检测到; 低温胁迫会抑制其相关蛋白的表达, 加入褐藻胶寡糖后会抵抗低温胁迫的影响, 大幅度提升表达的蛋白丰度; 加入褐藻胶寡糖后的水稻更倾向于一些独特蛋白的产生。Hamamoto 等[36]曾应用 MS 光谱强度研究水稻幼苗绿化过程的蛋白质组学特征, 对相对丰富的蛋白质进行半定量分析。Xu 等[20]用生物化学和蛋白质组学相结合的方法, 发现与提升小麦耐寒能力有关的因素是高活性的除氧蛋白和高丰度的光合作用蛋白。
图6 水稻幼苗DEPs富集的前10条关键性通路
Fig. 6 Top 10 key pathways for DEPs enrichment in rice seedlings
对 UPLC-Q-TOF-MS 得到的原始数据进行特征值提取, 然后进行对库, 将对库得到的每种样品的5 次重复数据进行归一化处理和缺失值补充, 得到稳定存在的代谢物。正离子模式下, 日本晴水稻共鉴定出 1725 种代谢物; 负离子模式下, 日本晴水稻共鉴定出 827 种代谢物。
通过偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA), 将得到的小分子代谢物手动分成两类, 筛选 VIP 值>1, p<0.05 的代谢物作为小分子差异表达代谢物。两种模式下的小分子差异表达代谢物详细信息见表 4 和 5。实验组在两种模式下鉴定到的数目: CvsN 为 709 个, RvsN为 1137 个, RvsC 为 791 个。
通过在线分析平台 KEGG Mapper Search (https: //www.kegg.jp/kegg/mapper/search.html)进行差异小分子代谢物的代谢通路分析。正负离子两种模式下能匹配到 KO 号的差异代谢物数目见表 6 和 7。空白组水稻幼苗 CvsN 富集到两个及以上代谢物的通路有代谢途径、次生代谢物的生物合成、类胡萝卜素生物合成、α-亚麻酸代谢、角质、木脂和蜡的生物合成。RvsN 富集到的通路有代谢途径、次生代谢物的生物合成、α-亚麻酸代谢、托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成、角质、木脂和蜡的生物合成。RvsC 富集到的通路有代谢途径、次生代谢物的生物合成、哌啶和吡啶生物碱生物合成、角质、木脂和蜡的生物合成、类胡萝卜素生物合成。实验组的水稻幼苗 CvsN 富集到两个及以上代谢物的通路有次生代谢物的生物合成、代谢途径、α-亚麻酸代谢、托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成。RvsC 富集到的通路有代谢途径、次生代谢物的生物合成、辅因子的生物合成、α-亚麻酸代谢、托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成。
表4 正离子模式下空白组与实验组的小分子差异表达代谢物数目
Table 4 Number of small molecule differentially expressed metabolites between the blank and experimental groups under positive ion mode
组别CvsNRvsNRvsC CK618432710 EG431836480
表5 负离子模式下空白组与实验组的小分子差异表达代谢物数目
Table 5 Number of small molecule differentially expressed metabolites between the blank and experimental groups under negative ion mode
组别CvsNRvsNRvsC CK303266304 EG278301311
表6 正离子模式下水稻幼苗能匹配到KO号的差异表达代谢物数目
Table 6 Number of differentially expressed metabolites that can be matched to KO in rice seedlings under positive ion mode
组别CvsNRvsNRvsC CK215214272 EG185308199
表7 负离子模式下水稻幼苗能匹配到KO号的差异表达代谢物数目
Table 7 Number of differentially expressed metabolites that can be matched to KO in rice seedlings under negative ion mode
组别CvsNRvsNRvsC CK103106103 EG87120112
本研究将代谢物分成 18 类, 分别为硫化物、酯类、酮类、酰亚胺、萜烯、芳香族、酚类、烷、醚类、羧酸、胺类、醛类、脂肪酸、生物碱、糖类、糖苷、核苷酸和氨基酸。从图 7 可以看出, 水稻鉴定到较多数目的代谢物种类为胺类, RvsC, RvsN 及CvsN 数目分别为 21, 26 和 18。多胺是响应植物各种胁迫的重要介质, 在许多不同的环境胁迫中发挥重要作用, 包括盐、干旱、低温和高温等, 还参与植物的非生物胁迫响应[37]。有研究表明, 外源性褪黑激素通过增加胡萝卜悬浮细胞中多胺(尤其是腐胺)的水平来减轻冷诱导的细胞凋亡[38], 因此可以推测褐藻胶寡糖参与调节代谢物的生物合成, 提高水稻的耐寒性。其次是羧酸, RvsC, RvsN及 CvsN 数目分别为 9, 15 和 5。羧酸等有机酸直接影响到植物的新陈代谢活性, 且有机酸也与植物的抗逆性相 关[33]。然后是生物碱、糖苷、核苷和核苷酸、氨基酸等, 说明这些代谢物也与水稻的生长密切相关。当植物受到逆境侵害时, 如温度胁迫、重金属胁迫和虫害等, 植物的新陈代谢会受到严重影响。例如, 氨基酸在逆境前后会发挥作用, 提高植物的抗逆性, 并且氨基酸分子量小易于植物的吸收, 对植物的生长有帮助。
以日本晴水稻为实验材料, 探究褐藻胶寡糖处理对水稻幼苗在低温胁迫下的诱导作用。通过生理生化指标的测定、蛋白组学分析和代谢组学分析, 得到如下主要结论。
1)褐藻胶寡糖处理过的水稻幼苗长势优于空白组, 并能在遭遇低温胁迫时帮助其抵御冷胁迫造成的伤害。在低温胁迫下, 褐藻胶寡糖会促进水稻自身产生更多的叶绿素和可溶性糖, 提高抗氧化酶的活性, 同时抑制丙二醛的生成, 从多方面提升水稻幼苗的抗寒性。
图7 正负离子模式下水稻幼苗能匹配到KO号的小分子差异表达代谢物分类
Fig. 7 Classification of small molecule differentially expressed metabolites which can match KO in rice seedlings under positive and negative ion modes
2)水稻幼苗经褐藻胶寡糖处理过后, 有不同的差异表达蛋白来响应水稻生长全过程, 并且实验组比空白组富集到更多条目。
3)褐藻胶寡糖可以调控水稻蛋白的丰度, 抵抗低温胁迫对光合作用的影响, 使表达的蛋白丰度提高。
4)褐藻胶寡糖在水稻生长的各个阶段对其代谢物的生成均产生影响。小分子差异代谢物主要为胺类, 其次为羧酸和生物碱等。
本文研究结果有利于加深对水稻抗寒性能防御机制的理解, 也可为褐藻胶寡糖作为植物生长调节剂应用于农业生产提供理论依据。
附录1 水稻幼苗光合作用途径中空白组与实验组产生的共同蛋白
Appendix 1 Common proteins produced by blank and experimental groups in the photosynthetic pathway of rice seedlings
算法参数设置 PSOc1=2, c2=2, w=0.9 GWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) SSA探索与开发的权衡因子c1=1, 移动距离随机系数c2∈[0, 1], 移动距离随机系数c3∈[0, 1] WOAc1∈[0, 1], c2∈[0, 1] GApc=0.5, pm=0.1 DECR=0.2, F=0.9 CMA-ESalphamu=2 IGWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) EAGDECR1∈[0.05, 0.15], CR2∈[0.9, 1.0], F∈[0.1, 0.9], Nmin=12 L-SHADE iL-SHADE JSO ELSHADE-SPACMA AGSK EBLSHADE SMA寻找食物操作概率z=0.03 AOSMA寻找食物操作概率z=0.03 BTSMA寻找食物操作概率z=0.03, K=30, β∈[0.1, 1], p=0.5 CNMSMA寻找食物操作概率z=0.03, 混沌映射初点x=0.7 COSMA寻找食物操作概率z=0.03, β∈[0, 1] DASMA寻找食物操作概率z=0.03, DN=2 DFSMA寻找食物操作概率z=0.03, DR∈[0, 0.4] ESMA寻找食物操作概率z=0.03, β=s=0.5
续表
算法参数设置 PSOc1=2, c2=2, w=0.9 GWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) SSA探索与开发的权衡因子c1=1, 移动距离随机系数c2∈[0, 1], 移动距离随机系数c3∈[0, 1] WOAc1∈[0, 1], c2∈[0, 1] GApc=0.5, pm=0.1 DECR=0.2, F=0.9 CMA-ESalphamu=2 IGWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) EAGDECR1∈[0.05, 0.15], CR2∈[0.9, 1.0], F∈[0.1, 0.9], Nmin=12 L-SHADE iL-SHADE JSO ELSHADE-SPACMA AGSK EBLSHADE SMA寻找食物操作概率z=0.03 AOSMA寻找食物操作概率z=0.03 BTSMA寻找食物操作概率z=0.03, K=30, β∈[0.1, 1], p=0.5 CNMSMA寻找食物操作概率z=0.03, 混沌映射初点x=0.7 COSMA寻找食物操作概率z=0.03, β∈[0, 1] DASMA寻找食物操作概率z=0.03, DN=2 DFSMA寻找食物操作概率z=0.03, DR∈[0, 0.4] ESMA寻找食物操作概率z=0.03, β=s=0.5
说明: CK 为空白组, EG 为实验组(AOS 处理); N 为正常生长情况, C 为低温胁迫, R 为复性。
附录2 水稻幼苗光合作用途径中实验组产生的差异蛋白
Appendix 2 Differential proteins produced by the experimental group in the photosynthetic pathway of rice seedlings
算法参数设置 PSOc1=2, c2=2, w=0.9 GWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) SSA探索与开发的权衡因子c1=1, 移动距离随机系数c2∈[0, 1], 移动距离随机系数c3∈[0, 1] WOAc1∈[0, 1], c2∈[0, 1] GApc=0.5, pm=0.1 DECR=0.2, F=0.9 CMA-ESalphamu=2 IGWO收敛因子α=2 (由2线性衰减至0) EAGDECR1∈[0.05, 0.15], CR2∈[0.9, 1.0], F∈[0.1, 0.9], Nmin=12 L-SHADE iL-SHADE JSO ELSHADE-SPACMA AGSK EBLSHADE SMA寻找食物操作概率z=0.03 AOSMA寻找食物操作概率z=0.03 BTSMA寻找食物操作概率z=0.03, K=30, β∈[0.1, 1], p=0.5 CNMSMA寻找食物操作概率z=0.03, 混沌映射初点x=0.7 COSMA寻找食物操作概率z=0.03, β∈[0, 1] DASMA寻找食物操作概率z=0.03, DN=2 DFSMA寻找食物操作概率z=0.03, DR∈[0, 0.4] ESMA寻找食物操作概率z=0.03, β=s=0.5
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Applying Multiomics Techniques to Study the Mechanism of Alginate Oligosaccharides Improving the Cold Resistance of Rice Seedlings
Abstract Nipponbare rice was selected as the research object, and the whole process of rice seedlings from normal growth to low temperature to recovery was simulated. In combination with the determination of physiological and biochemical indicators of rice seedlings, it was found that the application of alginic oligosaccharides not only improved the ability of rice seedlings to resist low temperature stress, but also improved root vitality and the activities of SOD, POD, CAT. At the same time, when rice seedlings are subjected to low temperature stress, alginate oligosaccharides could promote the production of soluble sugars and effectively inhibit the increase of malon-dialdehyde content in rice seedlings. Label-free quantification was used to identify and analyze differential proteins and metabolites and study their metabolic pathways. After GO annotation of differentially expressed proteins, the experimental group enriched more entries. The first 10 key pathways were obtained by KEGG enrichment. Metabolomic analysis of rice seedlings by UPLC-Q-TOF-MS showed that the main small molecule differential metabolites were amines, followed by carboxylic acids and alkaloids. Through multiomics analysis, the mechanism of alginate oligosaccharides in improving the cold resistance of rice seedlings was elucidated, which provided a scientific basis for understanding the defense mechanism of cold resistance of rice seedlings as well as the development and utilization of alginate oligosaccharides.
Key words rice seedlings; alginate oligosaccharides; cold resistance performance; proteomics; metabolomics