出芽短梗霉LHS-m022黑色素葡聚糖的发酵影响因素和生物活性

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 5 (Sept. 2024)

1.山东建筑大学市政与环境工程学院, 济南 250101; 2.山东财金投资集团, 济南 250002; 3.山东大学生命科学学院, 青岛 266237; †E-mail: xingsheluan@126.com

摘要为探索出芽短梗霉 LHS-m022 黑色素多糖的发酵影响因素和生物活性, 采用菌种发酵、分离提取及生物检测方法, 对发酵液性质、产物收率、生物转化率及生物活性进行测定分析。结果表明, LHS-m022 黑色素多糖发酵的最佳碳、氮源分别是蔗糖和胰酪蛋白胨, 蔗糖最佳浓度为 60g/L; 发酵培养基中诱导剂 L-多巴的最适添加量为 2.0g/L, 发酵液黑变活性和生物转化率分别是 2.481 和 71.93%; 细胞通透剂鼠李糖脂的最适添加量是 0.021μL/L, 发酵液黑变活性和生物转化率分别高达 2.794 和 73.9%。全波长扫描、FTIR 与 HPLC 分析表明, WAI 为黑色素, PsB 为黑色素葡聚糖结构。研究结果揭示, 粗黑色素葡聚糖样品经 121℃以上高温处理, 仍然得到 95.37%的絮凝率。采用 1.50 和 2.00g/L 的样品浓度进行检测, 分别得到 99.55%的羟自由基清除活性和 99.00%的抗氧化活性。

关键词 出芽短梗霉 LHS-m022; 黑色素葡聚糖; 黑变活性; 生物转化率; 抗氧化活性; 羟自由基清除活性

生物黑色素是生物圈中发现的最丰富的天然色素之一, 存在于动物、植物和微生物中, 具有复杂的酚类或吲哚类非均质的多聚物结构[1]。近年来, 随着对生物资源的深入研究, 生物黑色素的开发引起科技界的极大关注。由于具有高生物相容性和生物活性多样性, 黑色素已作为功能性生物材料广泛应用于食品、保健品、医药、化妆品、生物高分子和环境保护等领域。

多糖是一种绿色的可再生生物资源。在几千年的历史长河中, 多糖为人类的生存和发展提供了极具使用价值的产品[2]。近年来, 人们发现微生物多糖在抗肿瘤、抗病毒、抗免疫刺激、抗炎症、抗氧化作用和抗微生物作用等方面表现出显著的生物活性[3], 并且多糖具有获取方便、价格便宜、用途广泛的优势。

微生物黑色素多糖是特定菌种在特殊环境下产生的黑色素与多糖的复合物, 这种结构的复合物势必带来生命保护生理功能的拓宽和加强。有研究发现, 某些特殊的细胞既能产生黑色素又能产生多糖, 在代谢方面, 多糖的存在诱导黑色素的合成, 黑色素的合成又促进多糖的产生, 黑色素与多糖交联[4]、包裹[5]、锚定[6]在一起, 形成复合物结构。这种复合物结构形式从代谢方面相互促进了两种产物的合成, 从活性方面增加或增强了生物功能[7]。Bull[8]发现, 真菌构巢曲霉细胞壁中黑色素与氨基多糖交联的复合物能够抵抗微生物和外切 β-D-1,3-葡聚糖酶的裂解。Suzuki 等[9]从米曲霉发酵制成的黑醋中获取类黑素葡聚寡糖, 这种复合物具有抗氧化、防结肠炎发展、调整认知紊乱和抗肥胖的功能。在烟曲霉分生孢子形成过程中, 黑色素和几丁质复合物保证了细胞壁结构的完整性[10]。另有一项实验证明, 一株药用蘑菇产生的黑色素葡聚糖复合物具有高效的抗 HIV 感染作用[11]。因此对黑色素多糖的研究和开发具有潜在的应用前景和经济价值。

本文聚焦研究分离菌株出芽短梗霉 LHS-m022黑色素葡聚糖的发酵影响因素及相关生物活性, 期望为生物新资源开发利用提供一条新技术途径。

1 材料与方法

1.1 菌种

出芽短梗霉 LHS-m022 为本研究筛选获得, 菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国, 北京), 登记入册编号为 CGMCC No: 23050。

1.2 培养基与配制

液体菌种培养基: 葡萄糖 15 g/L, 玉米浆 2 g/L, K2HPO4∙3H2O 4 g/L, KH2PO4 1.5 g/L, MgSO4∙7H2O 1 g/L, FeSO4∙7H2O 0.002 g/L, 水1000mL, pH 7.0。

发酵基础培养基: 葡萄糖 20 g/L, 玉米浆 3 g/L, K2HPO4∙3H2O 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4∙7H2O 1 g/L, FeSO4∙7H2O 0.002 g/L, MnCl2 0.007 g/L, 水 1000mL, pH 6.5。

根据需要配制上述培养基, 用 10%的 NaOH 溶液调整 pH 后分装。在 250mL 三角瓶中加入 50mL液体菌种培养基, 在 500mL 三角瓶中加入 100mL在发酵基础培养基基础上配制的发酵培养基, 用纱布封口, 在高压蒸汽锅内 121℃灭菌 25 分钟。

1.3 主要试剂

玉米浆为试剂级, 由安琪生物科技有限公司提供; 胰酪蛋白胨为试剂级, 购于北京宏润宝顺科技有限公司; 大豆蛋白胨为食品级, 由山东玉宝生物科技股份有限公司提供; DPPH 和 L-多巴为分析纯, 购于美国阿拉丁工业公司; 50%鼠李糖脂为生化试剂, 由山东齐鲁生物科技基团提供; 其他试剂均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司。

1.4 仪器与设备

所用仪器包括 Sartorius BSA1245 电子天平(d= 0.1mg, 德国赛多利斯股份有限公司)、SevenCompact pH 计(梅特勒–托利多仪器(上海)有限公司)、ZQPZ-115 摇瓶机(天津莱玻瑞特仪器设备有限公司)、SW- CJ-2D 双人净化工作台(浙江苏净净化设备有限公司)、LRH-250F 生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、GL-21B 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、NDJ-8S 旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司)、IRPRESTIGE-21 AIM8800 傅里叶变换显微红外光谱仪(日本岛津公司)、ZR4-6 混凝试验搅拌仪(深圳中润技术发展有限公司)、UNIC UV2100紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)、L18-P516 高速破壁机(九阳股份有限公司)、N-1001旋转蒸发仪(东京理化株式会社)和 ALPHA 2-4LD冷冻干燥机(德国 CHRIST公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 菌种培养与发酵方法

用活化后的斜面菌种接种液体菌种培养基, 控制在 24～27℃和 180r/min 的条件下, 摇床培养 22 小时, 获得液体菌种。按体积分数 8%的接种量, 将液体菌种接种发酵培养基, 在 24～27℃和 180r/min 条件下震荡培养 18 小时, 然后 30～33℃继续培养 50 小时, 获得黑色素多糖发酵液。

1.5.2 发酵液黏度的测定

取 25℃发酵液 80mL, 用旋转黏度计 2 号转子在 6r/min 下进行测定, 黏度单位为 mPa∙s。

1.5.3 发酵液黑变活性的测定

采用分光光度法, 测定发酵液的黑变活性[12]。将发酵液稀释 20 倍, 用 1cm 玻璃比色杯在 420nm波长下测定 OD420nm 值, 并将其定义为发酵液黑变活性(blackening activity)。

1.5.4 WAI与PsB的提取

把发酵液加热至 85℃, 维持 15 分钟, 冷却到50℃, 然后用风味蛋白酶分解 3 小时, 10000r/min 高速离心 15 分钟, 将沉淀 1 与上清液 2 分开。在沉淀 1 中加入 6 倍体积的 42℃温水, 搅拌均匀, 12000r/min 高速匀浆破壁 3 分钟, 然后 10000r/min 离心15 分钟得到沉淀。沉淀加两倍体积的无水乙醇洗涤, 3000r/min 离心 5 分钟。取沉淀在 48℃过夜干燥, 称干重, 得到不溶于水和乙醇的黑色素, 命名为 WAI。上清液 2 中加入 1.3 倍体积的无水乙醇, 搅拌 3 分钟, 3000r/min 离心 5 分钟得到沉淀(沉淀的醇洗、离心和干燥条件同沉淀 1), 得到溶于水、不溶于乙醇的黑色素多糖, 命名为 PsB。定义生物转化率如下:

1.5.5 柱层析多糖纯化

柱层析多糖纯化方法[13]的步骤如下。

1)CTAB 法除蛋白: 将上述 PsB 配成 1%水溶液, 用 CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)法去除蛋白。取去除蛋白后的水相, 真空减压浓缩后冷冻干燥。

2)离子交换和凝胶过滤纯化: 把经过 CTAB 法除蛋白的样品配成 1%浓度的水溶液, 经过 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱(1.6×40cm 玻璃柱, pH 7.6 Tris∙HCl 缓冲体系和 0.7mol/L NaCl 洗脱液)和 Sephadex G200 凝胶过滤柱(1.5×60cm 玻璃柱, 平衡和洗脱液为 0.05mol/L NaCl)依次处理, 然后浓缩, 干燥, 获得纯化 PsB 样品。

1.5.6 黑色素多糖的FTIR光谱定性分析

参照栾兴社[14]的方法, 将纯化 PsB 样品进行KBr 压片, 用显微红外光谱仪进行官能团检测。

1.5.7 黑色素多糖的单糖组分HPLC分析

使用张璐等[15]的方法, 将纯化 PsB 样品进行酸解, 衍生, 用高压液相色谱仪进行单糖组分分析。

1.5.8 絮凝活性测定

在栾兴社[16]方法的基础上改进, 即在 200mL刻度絮凝杯中加入 196mL pH7.5、质量分数为 0.4%的高岭土悬液和 4mL 5%的 CaCl2 溶液, 配成絮凝体系。测定时, 在室温条件下往量筒中加入样品 30μL, 以 120r/min 转速快速搅拌 40 秒, 再以 60r/min转速缓慢搅拌 120 秒, 然后静止 10 分钟, 吸取上清液, 用分光光度法测定样品 OD550nm 值。用 30μL 蒸馏水代替样品, 测定空白对照组的 OD550nm值。絮凝活性用絮凝率(flocculation rate, FR)表示:

1.5.9 抗氧化活性测定

采用 DPPH 法[17]测定抗氧化活性。DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)是一种稳定的自由基, 其乙醇溶液呈紫色, λmax=517nm, 当 DPPH 溶液中加入抗氧化剂时, 颜色变浅, 吸光度变小。抗氧化活性用抗氧化率表示, 计算公式为

式中, ADPPH 表示 DPPH 对照 OD517nm 值, A 样品对照表示样品对照 OD517nm 值, A 样品表示样品加入 DPPH 溶液后的 OD517nm值。

1.5.10 羟自由基清除功能测定

邻二氮菲–金属铁离子–H2O2 配合物体系产生羟自由基∙OH, ∙OH 会使其配合物在 536nm 波长处的吸光值减弱。若加入对∙OH具有清除能力的物质, 则在 536nm 波长处的吸光值降低不明显[18]。使用朱月等[18]的方法测定羟自由基清除功能:

式中, A1 为未损伤管的 OD536nm 值, A2 为损伤管的OD536nm 值, A5 为样品管的 OD536nm值(A4)减去样品空白管的 OD536nm值(A3)。

2 结果与分析

2.1 培养基成分对出芽短梗霉 LHS-m022 黑色素多糖的影响

2.1.1 碳源对黑色素多糖的影响

在发酵基础培养基中, 分别加入 20g/L 的木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和混合糖(葡萄糖:蔗糖的质量分数=2:3)配制发酵培养基, 将液体菌种按体积分数 8%的接种量接种, 进行黑色素多糖发酵。发酵液的理化指标和生物转化率数据列于表 1, 可以看出, 蔗糖发酵液的黏度和 PsB 质量浓度分别为 1392mPa·s 和 6.33g/L, 是最好的碳源, 其次是混合糖。麦芽糖具有突出的黑变活性, 但黏度和生物转化率明显低于蔗糖和混合糖。

2.1.2 氮源对黑色素多糖的影响

制备发酵培养基时, 分别加入 3g/L 的 4 种无机氮源(NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4 和(NH4)2HPO4)以及 4 种有机氮源(玉米浆、麦芽提取物、胰酪蛋白胨和鱼粉蛋白胨)进行发酵, 实验结果见表 2。可以看出, 有机氮源普遍优于无机氮源, 其中胰酪蛋白胨为最佳氮源, 其发酵液黏度、黑变活性、WAI 质量浓度、PsB 质量浓度以及生物转化率均最高, 分别为 1061mPa·s, 1.015, 8.01g/L, 5.70g/L 和 69%, 这是由于胰酪蛋白胨特有的氨基酸组成和复合成分产生了最佳的发酵效果。

2.1.3 蔗糖浓度对黑色素多糖的影响

在基础培养基中加入 3.0%的胰酪蛋白胨, 以蔗糖为碳源, 将蔗糖浓度分别设定为 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68 和 76g/L, 配制发酵培养基。发酵后的测定结果如表 3 所示。可以看出, pH 值稳定, 黑变活性随蔗糖浓度增加而逐步提高。最佳蔗糖浓度为 60g/L, 发酵获得的最高 WAI 质量浓度和 PsB 质量浓度以及对应的具有生产意义的生物转化率分别为 15.10g/L, 20.33g/L 和 59.05%。用该浓度的蔗糖进行发酵, 能够获得单位发酵器容积的最高产品产量。

2.1.4 诱导剂对黑色素多糖的影响

用 L-多巴(L-Dopa)做诱导剂, 以 60g/L 的蔗糖为碳源, 3g/L 的胰酪蛋白胨为氮源, 分别加入 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 和 3.5g/L 的 L-多巴制备发酵培养基, 经发酵后进行测定, 数据列于表 4。结果表明, 未加 L-多巴的对照组已具有较高的黑变活性1.719 和生物转化率 59.97%, 加入 L-多巴能够明显地进一步提高发酵效果。随着 L-多巴添加量的提高, 发酵液 pH 逐渐降低, 黑变活性呈逐渐升高后又降低的趋势。L-多巴添加量为 2.0g/L 时的发酵效果最好, 其黑变活性和生物转化率最高, 分别达到2.481 和 71.93%, 与对照组相比, 黑变活性和生物转化率分别提高 44.33%和 19.94%, 适宜的 L-多巴浓度会显著地加强黑色素多糖的合成。实验结果说明, LHS-m022 是通过 L-多巴途径[19], 以 L-多巴为前体物质, 氧化聚合生成生物黑色素的。

2.1.5 通透剂对黑色素多糖的影响

采用鼠李糖脂为通透剂。鼠李糖脂是生物表面活性剂, 具有细胞膜通透剂的作用。细胞内合成的黑色素多糖小部分用于细胞构成, 大部分要通过细胞膜分泌到细胞外, 为了研究能否通过提高细胞膜的通透性来促进生物大分子产物分泌而设计本组试验。

配制鼠李糖脂浓度分别为 0, 0.003, 0.009, 0.015, 0.021, 0.027, 0.033 和 0.039μL/L 的发酵培养基进行黑色素葡聚糖发酵, 实验数据列于表 5。结果表明, 随着鼠李糖脂含量的不断增加, 发酵液的 pH 值略微降低, 黑变活性则逐渐增加, 达到最高点后基本上维持恒定。综合来看, 鼠李糖脂的最适添加量为0.021μL/L, 发酵后获得 2.794 的黑变活性和 73.90%的生物转化率, 黑变活性和生物转化率比对照组分别提高 32.98%和 4.04%。

2.2 黑色素与黑色素多糖样品分析

经过发酵液灭活、酶解、生物分离、匀浆和提纯等步骤得到的 WAI 和 PsB 样品如图 1 所示。WAI样品为粉状, 呈黑色; PsB 样品为液状, 呈黑色、均匀透明、有光泽。

2.2.1 全波长扫描

参照 Suzuki 等[9]的方法, 将提取的 WAI 样品在紫外分光光度计 190.0～910.0nm 全波长范围进行扫描。结果(图略)表明, 样品在 200nm 处有特征性吸收峰, 能吸收所有波长下的光线, 在其他光线区域吸收值随波长的增大而逐渐降低, 扫描样品为黑色素结构。

对纯化的 PsB 样品进行红外光谱检测, 从 FTIR光谱图(图 2)可以看出, 3409cm−1 处的强、宽特征性吸收峰为-OH 和-NH 基团的伸缩振动, 这些基团属于存在于吲哚类和吡咯系中的胺类、酰胺、羧酸、酚、芳香族氨基官能团及糖分子[20–21]。2925, 1428和 1372cm−1 吸收峰为黑色素脂肪族 C—H 的伸缩振动, 强的特征性吸收峰 1648cm−1通常是由羧基官能团的芳香族 C󠇥═C 和 C═O 的伸缩振动引起。特殊的黑色素伸缩振动在 1428cm−1, 这是由于吲哚系的N—H 的弯曲振动和 C—N (次胺)的伸缩振动。吸收峰 1202cm−1 是由酚-OH 的伸缩振动引起。在 1515, 1251 和 1157cm−1 显示的峰是由糖分子上 C—H 弯曲振动引起, 1079 和 1031cm−1 的峰是吡喃糖苷 C—O伸缩振动产生, 844cm−1 吸收峰则是糖分子上的 C1 —H 弯曲振动所致。图谱解析说明, 以上光谱数据都是黑色素和多糖的特征性吸收峰, 故纯化样品为典型的生物黑色素多糖物质。

2.2.3 HPLC单糖组分分析

用 HPLC 法对纯化 PsB 样品进行分析, 结果说明, 样品中含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、核糖和半乳糖醛酸 6 种单糖, 其质量比为98.36:1.10:0.36:0.27:0.19:0.07。样品中的多糖具体为葡聚糖。综合 FTIR 和 HPLC 的分析结果可以得出结论, 分析样品是黑色素葡聚糖复合物。

2.3 黑色素葡聚糖的生物学活性

在发酵基础培养基中加入 60g/L 的蔗糖, 3g/L的胰酪蛋白胨, 2.0g/L 的 L-多巴和 0.021μL/L 的鼠李糖脂, 配制发酵培养基。培养得到的发酵液经加热和风味酶处理(方法见 1.5.4 节)后, 用 1.3 倍体积的无水乙醇进行沉淀, 沉淀物用 6 倍体积无水乙醇进行洗涤, 3000r/min 离心 5 分钟, 然后取沉淀物在48℃过夜干燥, 粉碎, 80 目过筛, 得到粉状粗黑色素葡聚糖样品, 进行生物学活性测定。

本研究发现, 出芽短梗霉 LHS-m022 发酵产生的黑色素葡聚糖具有絮凝活性, 下面探索发酵液提取物经不同温度和时间处理后的絮凝活性状况。取粉状粗黑色素葡聚糖样品, 配制 200mL 1%浓度(质量体积比)的粗黑色素葡聚糖水溶液, 均等分成 4份, 处理方式分别为未处理对照、90℃水浴热处理60 分钟、100℃水浴热处理 30 分钟和 121℃高压蒸汽热处理 25 分钟。絮凝实验空白对照组的 OD550nm =1.794, 各处理组的 OD550nm 值和由式(2)计算得到的絮凝率如表 6 所示。粗黑色素葡聚糖抗高温, 具有高效絮凝活性。不同的高温处理絮凝率 FR 不但不降低, 反而有小幅度提高。这可能与分子构架呈棒状、刚性以及高温处理使得分子伸展、基团外露有关[22]。

2.3.2 抗氧化活性

取粉状粗黑色素葡聚糖样品, 依次配制成 6 个浓度(0.75, 0.86, 1.00, 1.20, 1.50 和 2.00g/L)的水溶液, 进行抗氧化活性实验。DPPH 对照的 OD517nm 值ADPPH=0.846, 测得的 OD517nm 数据和由式(3)计算得到的抗氧化率结果列于表 7。粗黑色素葡聚糖具有很强的抗氧化活性, 随样品含量增加, 抗氧化活性逐渐增强, 当样品含量为 2.00g/L 时, 抗氧化活性达到 99.0%。

2.3.3 羟自由基清除功能

取粉状粗黑色素葡聚糖样品, 配制成 5 个浓度(0.75, 0.86, 1.00, 1.20 和 1.50g/L)的水溶液进行羟自由基清除功能实验。A1=1.692, A2=0.955, A5 = A4 −A3, 由式(4)计算得到的羟自由基清除率见表 8。结果揭示, 粗黑色素葡聚糖具有突出的羟自由基清除功能, 随样品浓度增加, 清除率逐渐增强, 样品浓度为 1.50g/L时, 羟自由基清除率高达 99.95%。

3 结论与展望

选育菌株出芽短梗霉 LHS-m022 黑色素多糖发酵的最佳碳、氮源分别是蔗糖和胰酪蛋白胨, 蔗糖最佳浓度为 60g/L; 发酵培养基中加入诱导剂 L-多巴明显加强了发酵效果, 在最适加量 2.0g/L 时, 发酵液黑变活性和生物转化率分别是 2.481 和 71.93%, 与对照组相比分别提高 44.33%和 19.94%; 细胞通透剂鼠李糖脂的加入促进了产物合成与释放, 最适添加量为 0.021μL/L, 其发酵液黑变活性和生物转化率分别高达 2.794 和 73.9%, 比对照组分别提高32.98%和 4.04%。对发酵产物的结构和成分进行全波长扫描、FTIR 和 HPLC 分析, 结果表明 WAI 为黑色素, PsB 为黑色素葡聚糖结构。

粗黑色素葡聚糖样品生物活性的研究结果显示, 样品耐高温, 经 121℃以上的高温处理, 仍然得到 95.37%的高絮凝率; 样品的抗氧化活性和羟自由基清除活性强, 2.00g/L 的样品浓度可以得到 99.00%的抗氧化活性, 样品浓度为 1.50g/L 时的羟自由基清除活性高达 99.55%。鉴于以上优异性能, 黑色素和黑色素葡聚糖可应用于饲料、食品、保健品、生物医药、化妆品及环境保护等多个领域。

黑色素和黑色素葡聚糖在有机体防御和保护机制中发挥着至关重要和多功能的作用, 保证生命体在不利环境条件下的生存和竞争能力。这类物质是具有多种生物活性、高生物相容性和生物可降解性的生物材料, 未来可利用现代发酵工程方法使其实现自动化、清洁化、连续化与规模化工业生产。在本研究工作的基础上, 后续我们将研究用于食品着色的生物功能性黑色素以及抗贫血效果强且具有复合功能的黑色素葡聚糖铁, 以期满足日益增长的社会需求。

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Influencing Factors of Fermentation and Bioactivity of Aureobasidium pullulan LHS-m022 Melanin-Glucan

1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shandong Jianzhu University, Jinan 250101; 2. Shandong Finance Investment Group, Jinan 250002; 3. School of Life Science, Shandong University, Qingdao 266237; † E-mail: xingsheluan@126.com

Abstract To explore the influencing factors of fermentation and bioactivity of Aureobasidium pullulan LHS-m022 melanin-polysaccharide, using strain fermentation, isolation and extraction, and biological detection methods, the properties of the fermentation broth, product yield, bioconversion rate and bioactivity were determined and analyzed. The results showed that the best carbon and nitrogen sources of LHS-m022 melanin-polysaccharide fermentation were sucrose and casein peptone, and the optimal concentration of sucrose was 60 g/L. The optimal amount of indu-cer L-dopa in the fermentation medium was 2.0 g/L, and the blackening activity and bioconversion rate of the fermentation broth were 2.481 and 71.93%, respectively. The optimal amount of cell permeating agent rhamnolipid was 0.021 μL/L, and the blackening activity and bioconversion rate of fermentation broth were as high as 2.794 and 73.9%, respectively. Full wavelength scan, FTIR and HPLC analysis showed that WAI was melanin, and PsB was melanin-glucan structure. The research revealed that the crude melanin-glucan samples treated above 121℃ still gave 95.37% FR. Testing with the respective sample concentrations of 1.50 g/L and 2.00 g/L yielded the corres-ponding 99.55% hydroxyl radical scavenging activity and 99.00% antioxidant activity.

Key words Aureobasidium pullulan LHS-m022; melanin-glucan; blackening activity; bioconversion rate; antio-xidant activity; hydroxyl radical scavenging activity