图1 LOM (a), CIP (b)和MIX (c) (0～50 µg/L)对TH17脱氮性能的影响
Fig. 1 Effects of LOM (a), CIP (b) and MIX (c) (0–50 µg/L) on nitrogen removal by TH17
北京大学学报(自然科学版) 第60卷 第3期 2024年5月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 3 (May 2024)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2024.010
广东省自然科学基金(2023A1515030263)、深圳市高等院校稳定支持计划重点项目(GXWD20201231165807007-20200810165349001)和深圳技术大学新引进高端人才财政补助科研启动项目(GDRC202115)资助
收稿日期: 2023–04–08;
修回日期: 2023–04–24
摘要 针对一株氢氧化细菌 Ideonella sp. TH17 进行污水生物脱氨氮研究, 并应用分子生物学技术解析两种典型喹诺酮类抗生素及其混合物对 TH17 氨同化的影响途径和机理。结果表明, 低浓度(5µg/L)喹诺酮类抗生素对 TH17 脱氮性能具有促进作用, 浓度升高则出现抑制作用, 混合抗生素削弱了高浓度抗生素对 TH17 脱氮性能的抑制作用。在 5µg/L 喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 氨同化基因表达上调, 氨同化酶和抗氧化系统酶活性提升。同时, TH17 抗性基因表达上调, 增加了细胞的抗生素耐受性。进一步地, TH17 胞内氨基酸、嘌呤和生物素代谢等通路显著上调, 为氮代谢提供能量、底物和辅酶, 最终提升了氨同化性能。研究结果从基因、酶和代谢物分子水平上揭示了低浓度喹诺酮类抗生素对 TH17 脱氮性能的影响途径与机理, 可为污水生物脱氮新技术的开发和应用提供理论支撑。
关键词 氢氧化细菌; 氨同化; 抗生素; 代谢组学
随着社会经济的快速发展, 我国城镇生活污水含氮污染物排放量逐年增加, 引发水体富营养化和地下水污染等诸多水环境问题[1]。生物脱氮技术具有可持续性和运行成本低等优势, 是目前生活污水脱氮的主流技术[2]。传统的硝化反硝化生物脱氮工艺在硝化过程中需要曝气提供溶解氧, 反硝化过程需要额外添加碳源, 因而存在氨氮脱除不彻底、能耗高、碳排放量大和氮素损失等缺陷[3]。
氢氧化细菌(hydrogen-oxidizing bacteria, HOB)是一类自养型微生物, 能够利用 H2 作为电子供体, O2 作为电子受体, 固定 NH4+-N 和 CO2 来合成自身生长所需物质[4]。HOB 在氮循环中用同化的方式去除无机氮, 将无机氮转化为有机氮, 储存在细胞内维持细胞生命活动, 通过卡尔文循环或逆三羧酸循环的方式固定 CO2 来合成自身生长所需物质[4]。据此原理, 自养型 HOB 可将污水或污泥中的含氮污染物转移到微生物细胞中, 实现高效生物脱氮[5]。相比于传统的方法, HOB 生物脱氮的方法不但能够高效地利用氨氮合成生物质, 而且不需要补充额外碳源, 不仅环保有效, 也更经济划算。HOB 生物脱氮法具有广阔的前景, 有助于污水处理厂的工艺升级和资源转型。但是, 现有研究成果与工程实际应用尚有一定的距离。
抗生素是一类能以低浓度影响微生物机体生理活性的新污染物, 使用量大, 检出频率高, 其中喹诺酮类抗生素最为典型。污水处理厂废水中不同喹诺酮类抗生素的浓度范围在 10ng～100µg/L 之间[6–7], 往往以多种抗生素混合的形式存在, 其中, 洛美沙星(Lomefloxacin, LOM)和环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)检出量最高, 平均浓度为 10～20µg/L[7]。目前, 喹诺酮类抗生素对污水处理过程中微生物的作用机制仍不明确, 需进一步探究其长期存在对 HOB 脱氮性能的影响机理。
代谢组学是一门对生物体或细胞内所有代谢产物进行定量和定性分析的新技术[8]。当上游的胞内基因和蛋白质表达发生微小变化时, 最下游的代谢组学能够将其在代谢物水平上进行放大, 更加充分地反映细胞功能水平[9]。有研究显示, 在重金属、纳米材料和各种有机污染物的胁迫下, 酵母菌、大肠杆菌和不同的微藻均表现出物质和能量代谢途径上的波动[10–11]。其中, 代谢组学技术可直接应用于土壤环境中的混合微生物群体, 无需分离和纯化菌种, 直接获得糖、氨基酸和脂肪酸代谢产物的上调或下调等规律[12–13]。相比于高等生物体, 微生物具有基因组数据丰富以及基因调节、代谢网络和生理特性信息全面等优势, 使得微生物代谢组学数据更易与基因组学数据相关联[14]。因此, 代谢组学有望充分地反映在外界影响因子(如抗生素)的胁迫下, HOB 胞内氮代谢及相关功能的变化情况, 在分子层面解析污水生物脱氮机制。
本研究针对生活污水的氨氮污染问题, 探究以前期分离的 HOB 新菌株 Ideonella sp. TH17 为核心的生物脱氮方法, 考察喹诺酮类抗生素对 HOB 脱氮性能的影响规律, 分析细胞氨同化基因表达、功能酶活性和氮代谢相关通路的变化情况, 从分子层面解析喹诺酮类抗生素对 HOB 脱氮性能的影响途径与机理, 为 HOB 脱氮方法应用于实际污水处理提供理论支撑。
Ideonella sp. TH17(GenBank No. MN473286.1)矿物质培养基(1.0L)中包含 2.4g KH2PO4, 2.5g Na2HPO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.5g NaHCO3, 0.1g 柠檬酸铁铵和 1mL 微量元素溶液。其中, 微量元素溶液(1.0L)包含 0.6g H3BO3, 0.4g CoCl2·6H2O, 0.2gZnSO4·7H2O, 0.06g MnCl2·4H2O, 0.06g Na2MoO4·2H2O, 0.04g NiCl2·6H2O 和 0.02g CuSO4·5H2O。矿物质培养基经过 121oC 灭菌 20 分钟, 冷却至室温。其中, 柠檬酸铁氨单独灭菌(0.22µm 膜滤), 室温加入培养基。实验所用主要化学药剂均为 AR 级。喹诺酮类抗生素 LOM 和 CIP 购自北京百灵威科技公司(中国)。实验所用水均为超纯水(18.2MΩ·cm, Millipore, USA)。
在 250mL 的血清瓶中加入 70mL 培养基, 接种3.5mL 菌液(接种比为 5%, 体积比), 调节 pH 至 7.0, 通入混合气体(H2:O2:CO2 = 85:5:10, 体积比), 流量为 200mL/min, 通气时长为 2 分钟, 放置在摇床中于 25oC、200rpm 条件下密闭培养 72 小时。在 0, 12, 24, 48 和 72 小时分别取样 3.5mL, 经过 0.22µm膜过滤后用于各项检测。每次取样时置换瓶中混合气体。以不添加喹诺酮类抗生素为对照组(Control, CON), 将 LOM 和 CIP 及其等质量混合抗生素(Mixture, MIX)以 5, 10, 20 和 50μg/L 的浓度梯度分别加入实验体系中, 考察抗生素胁迫下的氨氮(NH4+-N)去除情况。NH4+-N 浓度采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009)测定。针对添加 5μg/L LOM, CIP, MIX 的实验组和 CON 对照组, 分别测定胞内代谢产物、功能基因表达及相关酶活性。每组实验进行 5 个平行操作。
1.3.1氨同化基因和抗性基因检测与分析
采用 SYBR Green I 法对 2 个脱氮相关基因(glnA和 gltD)和 1 个抗生素抗性基因(gyrA)进行绝对定量分析, 研究不同抗生素胁迫下各基因的表达水平差异。用试剂盒(HiPure Universal RNA Mini K, Magen, 中国)提取基因组 RNA, 反转录得到cDNA。根据全基因组扫描结果得到的基因序列, 利用 Primer Premier 5.0 软件设计 PCR 引物。glnA 的引物为GlnA-Fn: ATTTCGACGAGCTGTATGCG 和 GlnA-Rn: CGTGGCGGAAGTTGACCT。gltD 的引物为GltD-F: GTCACTGGCTTCCTGGAATATG 和 GltD-R: TGAAGTCCGGGATGATGTTG。gyrA的引物为gyrA-F: CTATGACGGTTCCGAGAAAGAG 和 gyrA- R: GATTGTGTGGCGGGATATTG。qPCR 基因扩增程序: 95℃ 30s; 95℃ 10 s; 52～65℃ 30s (梯度扩增, 梯度温度为 52℃, 55℃, 60℃和 65℃); 72℃ 5 分钟; 16℃ 1 分钟; 40 个循环。所有实验均进行 6 组平行实验。
1.3.2氨同化酶和抗氧化系统酶活性测定与分析
分别测定谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydroge-nase, GDH)、谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)和谷氨酸合成酶(Glutamate synthetase, GOGAT) 3 种氨同化酶以及超氧化物歧化酶(Superoxide dis-mutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)两种抗氧化系统酶活性。采用酶联免疫吸附方法, 设置标准品孔和样本孔。在标准品孔中加入不同浓度的标准品(50μL), 在样本孔中先加入待测样本(10μL), 然后加入样本稀释液(40μL)。空白孔不添加任何物质, 标准品孔和样本孔中加入 100μL 辣根过氧化物酶标记的检测抗体, 用封板膜封住反应孔, 37℃恒温箱温育 60 分钟。温育后, 重复洗板 5 次。每孔加入底物, 37℃避光孵育15 分钟。在 15 分钟内加入 50μL 终止液, 并在 450nm 波长处测定各孔的吸光度值, 计算样品的酶 活性。
1.3.3细胞代谢物检测
取 20mL 培养 72 小时的菌液离心 10 分钟(4℃, 4500rpm), 弃上清液。每次用 10mL 生理盐水清洗沉淀, 清洗 3 次。用 1mL 甲醇–水(4:1, 体积比)将沉淀溶解, 并转移到玻璃小瓶中, 加入 200μL 氯仿混匀。冰水浴超声 6 分钟, 加入 40μL 内标(0.06mg/ mL L-2-氯苯丙氨酸的甲醇溶液), 再次冰水浴超声20 分钟, 于−40℃静置 30 分钟。4℃条件下, 13000rpm 离心 10分钟, 移取上清液 800μL 到玻璃小瓶中挥干, 再用300μL 甲醇-水(1:4, 体积比)复溶。于−40℃静置 2 小时后, 离心 10 分钟(13000rpm, 4℃), 吸取 150μL 的上清液, 经 0.22μm 有机相膜过滤后, 进行气相色谱(ACQUITY UPLC I-Class plus, Waters, USA)–质谱联用(Q Exactive Plus, Thermo, USA)分析代谢产物。
通过多元统计分析方法, 对代谢物检测数据进行无监督分析, 验证分析过程的稳定性。结合多维和单维分析方法, 用最小二乘法分析来区分各组间代谢轮廓的总体差异, 通过 T 检验寻找组间潜在的差异代谢产物, 在 MetaboAnalyst 平台进行代谢通路的富集分析。
如图 1 所示, 当 LOM 添加量在 5, 10 和 20µg/L时, 对 TH17 的脱氮效果具有促进作用, 24～72 小时内的 NH4+-N 去除率均高于 CON 组; 当添加量增至50µg/L 时, 脱氮效果则受到较为明显的抑制, 72 小时内的 NH4+-N 去除率明显低于 CON 组(图 1(a))。当 CIP 添加量在 5 和 10µg/L 时, 对 TH17 的脱氮效果具有促进作用, 24～72 小时内的 NH4+-N 去除率均高于 CON 组; 当 CIP 添加量增至 20µg/L 时, 脱氮效果则受到一定程度的抑制, 72 小时内的 NH4+-N去除率比 5µg/L 组和 10µg/L 组有所降低, 且略低于CON 组; 当添加量增至 50µg/L 时, 脱氮效果受到更加明显的抑制, 72 小时内的 NH4+-N 去除率进一步明显降低(图 1(b))。两种喹诺酮类抗生素单独对TH17 脱氮效果的影响表现出低浓度促进、高浓度抑制的特征。当 MIX 添加量在 5, 10, 20 和 50µg/L时, 对 TH17 的脱氮效果均有轻微的促进作用, 72小时内的 NH4+-N 去除率均略高于 CON(图 1(c))。不同抗生素对 TH17 脱氮性能的影响存在一定程度的差异, 各自的抑制阈值范围不同, LOM 介于 20～ 50µg/L 之间, CIP 介于 10～50µg/L 之间, MIX 则高于50µg/L。混合抗生素削弱了高浓度抗生素对 TH17脱氮性能的抑制作用。
图1 LOM (a), CIP (b)和MIX (c) (0～50 µg/L)对TH17脱氮性能的影响
Fig. 1 Effects of LOM (a), CIP (b) and MIX (c) (0–50 µg/L) on nitrogen removal by TH17
低浓度(5µg/L)单一或混合种类的喹诺酮类抗生素均能够促进 TH17 脱氮功能基因表达。全基因组扫描结果显示, TH17 具有两条氨同化代谢通路: 1) AMMONIA—L-GLUTAMATE (谷氨酸, GLU)和2)AMMONIA—L-GLUTAMINE—L-GLUTAMA-TE。参与氨同化的酶为 GDH (EC 1.4.1.3)、GS (EC 6.3.1.2)和 GOGAT (EC 1.4.1.14 和 EC 1.4.1.13)。其中, glnA 与 gltB 编码 GS/GOGAT, gltD 编码 GDH。在 5µg/L 喹诺酮类抗生素长期胁迫下, TH17 的 glnA和 gltD 基因表达量均显著增加(图 2(a)), 进而促进氨同化功能, 与表观脱氮性能参数相吻合。同时, 低浓度喹诺酮类抗生素能够诱导 TH17 的耐药性, 以适应外部环境的长期胁迫压力。gyrA 是喹诺酮类抗生素的靶标基因[15], 在不同单一、混合喹诺酮类抗生素的长期胁迫下, 其表达水平均显著上调(图 2(b)), 且在 CIP 促进作用下的表达程度增加最为明显。
在 5µg/L 单一或混合种类的喹诺酮类抗生素胁迫作用下, TH17 胞内的氮同化相关酶活性提高22%～87%。TH17 同化 NH4+-N 包括 GDH 和 GS/ GOGAT 两种典型途径: 1)通过 GDH 途径与 α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid, α-KG)反应生成 GLU; 2)通过GS/GOGAT 途径同化生成 GLU 和 GLN, 该途径是氨同化生成谷氨酸和谷氨酰胺的重要途径。在 5µg/L 喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 胞内的 GS/ GOGAT 酶活性显著高于 CON 组(图 3(a)), 表明喹诺酮类抗生素胁迫促进了氨同化 GS/GOGAT 途径。不同组别抗生素对 GS/GOGAT 酶活性的促进效果排序为 LOM>CIP>MIX。该结果印证了 TH17 胞内 gltD 基因表达提升对NADH-GOGAT 亚基功能的调控作用。此外, GS/GOGAT 通路相关的代谢物还可能参与细胞内的氮信号转导[16], 进而影响 TH17胞内 GS 和 GOGAT 酶活性及氮同化能力, 这与TH17 脱氮性能的实验结果一致。
图2 喹诺酮类抗生素(5 µg/L)胁迫下 TH17 的氨同化基因(glnA 和 gltD) (a)和抗性基因(gyrA) (b)表达
Fig. 2 Expression of ammonia assimilation genes (glnA, gltD) (a) and antibiotic resistance genes (gyrA) (b) in TH17 under stress of quinolone antibiotics (5 µg/L)
图3 喹诺酮类抗生素(5 µg/L)胁迫下TH17氨同化酶(a)和抗氧化防御系统酶(b)活性
Fig. 3 Activities of ammonia assimilation enzymes (a) and antioxidant enzymes (b) in TH17 under stress of quinolone antibiotics (5 µg/L)
喹诺酮类抗生素可诱导 TH17 细胞代谢变化, 产生过量活性氧(reactive oxygen species, ROS), 对细胞造成损害[17]。SOD 和 GSH-PX 是 TH17 内两种重要的抗氧化酶, 能够减轻 ROS 对 TH17 细胞的损伤。在 5µg/L LOM, CIP 和 MIX 的胁迫下, SOD 酶活性数值比 CON 显著下降, 表明 SOD 在 TH17 的抗氧化防御系统中发挥关键作用(图 3(b))。SOD 是微生物机体内最为重要的自由基清除剂[18], 可能首先在TH17 胞内被消耗, 以便清除过量 ROS, 削弱抗生素胁迫作用。同时, GSH-PX 酶活性数值略有上升, 可能是由于其在此抗生素浓度下具有更强的耐受ROS 能力, 能够应对 TH17 胞内 ROS 等物质, 保证细菌的完整结构和正常功能。
基于统计分析, 在 5µg/L LOM, CIP 和 MIX 胁迫下, 累计筛选出潜在差异代谢物 917 种, 包括LOM vs. CON 组 228 种, 上调 168 种, 下调 60 种; CIP vs. CON 组 340 种, 上调244种, 下调96种; MIX vs. CON 组 349 种, 上调 184 种, 下调 165 种。各实验组 vs. CON 组的差异代谢物主要是氨基酸、生物素、辅酶因子和脂肪酸等(图 4(a)～(c))。通过对差异代谢物进行富集, 确定 LOM, CIP 和 MIX 实验组vs. CON 组的显著差异代谢通路(P<0.05)分别有 6条、4 条和 3 条(图 4(d)～(f))。总体上, 在喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 胞内的大多数差异代谢通路呈现上调状态, 少部分呈现下调状态。
首先, 在 5µg/L 喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17胞内重要的氮代谢通路——氨基酸代谢途径上调, 表明喹诺酮类抗生素促进了细胞氨同化代谢活性。当微生物暴露于外界污染时, 体内氨基酸代谢变化是其重要的响应机制。其中, 谷氨酸是氨同化的重要中间代谢产物, 可以被 GDH 或丙氨酸或天冬氨酸转氨酶转化为三羧酸循环(TCA 循环)中间物 α- KG。α-KG 可在 ATP 产生以及补充 TCA 循环中间物的过程中发挥作用。因此, 谷氨酸代谢上调能够促进 TH17 胞内的 TCA 循环, 加强 TH17 对氮源的利用率。该结果与 TH17 胞内的 GOGAT 编码基因gltB 表达以及 GS/GOGAT 酶活性提升相吻合, 分别从基因、蛋白质和代谢物分子层面解释了脱氨效率的提升机理。同时, 谷氨酸在细菌体内能通过合成谷胱甘肽参与到 TH17 体内的抗氧化应激系统中[19], 减少 ROS 累积, 发挥抗氧化应激的功能[20]。本研究中, TH17 胞内谷氨酸代谢通路的上调以及 GS/ GOGAT 酶活的升高, 证明在喹诺酮类抗生素的胁迫下, TH17 可通过提高 GSH 的方式应对氧化应激产生的 ROS, 减少抗生素胁迫对细胞产生的伤害。
图4 LOM (a)、CIP (b)和 MIX (c) (5 μg/L)胁迫下 TH17 显著性差异(P < 0.05)代谢物以及 LOM (d)、CIP (e)和 MIX (f) (5 μg /L)胁迫下 TH17 氮代谢相关通路
Fig. 4 Differential metabolites of TH17 under stress of LOM (a), CIP (b) and MIX (c) (5 µg/L), and metabolic pathways related to nitrogen removal by TH17 under stress of LOM (d), CIP (e) and MIX (f) (5 µg/L)
其次, 低浓度喹诺酮类抗生素上调了 TH17 胞内的嘌呤代谢通路, 促进了菌体核苷酸合成, 提高了 TH17 的抗生素抗性。嘌呤化合物是细胞内的能量载体、辅酶, 也是遗传物质 DNA 和 RNA 的重要结构组分[21]。嘌呤代谢上调有助于为 TH17 提供能量以及蛋白酶等物质, 同时为基本的细菌合成遗传物质, 进行生长繁殖提供了基本的物质条件。环鸟苷酸(Cyclic guanosine 3',5'-cyclophosphate, cGMP)在实验组中显著上调, 可将胞外信号传导至细胞核进行调控, 参与细胞膜离子通道的开启以及糖原分解代谢为氮代谢提供能源物质, cGMP 上调进一步促进了 TH17 胞内的生长代谢。
此外, 在所有的实验组, 生物素代谢通路均处于上调状态, 且代谢通路 P 值均小于 0.05, 显著性水平较高, 表明低浓度的喹诺酮类抗生素促进了TH17 生物素合成代谢通路。其中, 核黄素和磷酸及一分子蛋白质能够结合成为黄素酶, 在生物氧化还原中发挥递氢作用, 对糖、脂质和氨基酸代谢至关重要。以往研究亦发现, 通过补充核黄素, 可以扭转抗生素对细菌生长的抑制作用[22]。同时, 烟酸和烟酰胺可以在细菌体内酶的催化下形成 NAD 和NADH, 参与细菌的能量供给代谢过程。因此, 在喹诺酮类抗生素的胁迫下, TH17 通过上调维生素代谢通路, 维持并促进了自身能量供给等代谢过程, 提升了氨氮的去除能力以及抗生素的抗性。
在低浓度喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 细胞首先通过 DNA 复制来增加氨同化基因 gltB 和 gltD 的表达水平, 进而通过转录合成大量氨同化通路相关酶 GS, GOGAT 和 GDH, 最终 NH4+-N 由氨同化酶催化形成谷氨酸, 参与氮代谢和 TCA 循环等通路。氮代谢上调可以提升谷氨酸含量, 谷氨酸先被转化为谷胱甘肽, 随后生产 GSH-PX 来参与清除 ROS 过程, 保证细胞正常生长代谢。同时, SOD 大量合成, 并不断被消耗用于缓解 ROS 对 TH17 细胞的氧化损伤。在喹诺酮类抗生素的胁迫下, 抗性基因 gyrA 大量复制并提升抗生素抗性, 提高了 TH17 细胞对喹诺酮类抗生素胁迫压力的耐受水平。嘌呤代谢、生物素代谢作为辅助代谢通路为核心通路——氮代谢提供了能量、底物和辅酶等物质, 促进胞内信号传递和细胞结构合成, 同时核黄素上调增加胞体抗生素的抗性, 最终共同促进污水中的 NH4+-N 被吸收和转化为胞内含氮有机物(图 5)。
在高浓度喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 胞内的靶标 DNA 回旋酶活性受到抑制, 从而阻止 DNA 复制过程[23]。TH17 胞体产生大量 ROS, 超出抗氧化防御系统的能力范围, 对细胞造成严重的氧化损伤, 致使 TH17 代谢活动受损、细胞活性下降甚至死亡, 生物脱氮性能减弱。
1)喹诺酮类抗生素对 TH17 脱氮效果呈低浓度促进、高浓度抑制的作用, 混合抗生素对 TH17 脱氮效果的抑制比单一抗生素弱。
2)在 5µg/L 喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 可能通过 AMMONIA—L-GLUTAMINE—L-GLUTAM-ATE 通路中氨同化基因 glnA 和 gltD 表达量增加以及抗性基因 gyrA 表达量增加, 提升对抗生素胁迫的耐受性。
3)在 5µg/L 喹诺酮类抗生素长期胁迫下, TH17胞内 GS/GOGAT 途径酶活性增加, 抗氧化酶 SOD酶活性下降, 减轻 TH17 细胞可能受到的损伤。
4)在 5µg/L 喹诺酮类抗生素长期胁迫条件下, 累计筛选出 917 种潜在差异代谢物, 13 条显著差异代谢通路(P<0.05)和 26 条差异代谢通路(P<0.1), 大多数差异代谢通路呈现上调状态, 少部分呈现下调状态。
5)在 5µg/L 喹诺酮类抗生素胁迫下, TH17 首先增加氨同化基因表达量, 进而促进氨同化酶合成, 从而提升氨同化脱氮功能。同时, 抗性基因表达上调保证 TH17 生长繁殖功能, 氧化防御系统酶清除过量活性氧, 为细胞氨同化代谢提供保障。
图5 喹诺酮类抗生素(5 µg/L)对TH17脱氮性能的影响途径与机理
Fig. 5 Pathways and mechanisms of nitrogen removal by TH17 under stress of quinolone antibiotics (5 µg/L)
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Pathways and Mechanisms of Nitrogen Removal by Hydrogen-Oxidizing Bacteria under Stress of Quinolone Antibiotics
Abstract A hydrogen-oxidizing bacterium Ideonella sp. TH17 was investigated for ammonium removal from wastewater. Possible pathways and mechanisms of nitrogen assimilation under the stress of two typical quinolone antibiotics and their mixture were studied by molecular biological approaches. The results showed that the capability of ammonium assimilation by TH17 was stimulated at lower concentration (5 µg/L), but inhibited at elevated concentration of quinolone antibiotics. The inhibitory effect of mixed antibiotics was weaker than that of individual antibiotics at higher concentration. Under stress of 5 µg/L quinolone antibiotics, the expression of ammonium assimilation genes was up-regulated, and activities of functional and antioxidant enzymes were enhanced. Meanwhile, the expression of antibiotic resistance gene was up-regulated, which increased the tolerance of TH17 to quinolone antibiotics. Further, amino acid, purine and biotin metabolisms were up-regulated significantly to provide energy, substrates, and coenzymes for enhanced nitrogen metabolism of TH17. Therefore, the influencing pathways and mechanisms of low-concentration quinolone antibiotics on nitrogen removal by TH17 were revealed by gene, enzyme and metabolite molecules, which could guide the development and application of novel processes for biological nitrogen removal from wastewater.
Key words hydrogen-oxidizing bacteria; ammonium assimilation; antibiotics; metabolomics