PHBV-硫铁矿基人工湿地处理实际污水处理厂尾水混合营养反硝化研究

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 2 (Mar. 2024)

1.郑州大学生态与环境学院, 郑州 450001; 2.北京大学环境科学与工程学院, 北京 100871; †通信作者, E-mail: wzwu@pku.edu.cn (吴为中), chxing@zzu.edu.cn (邢传宏)

摘要以河南省新乡市某大型污水处理厂尾水为研究对象, 开展模拟人工湿地尾水深度脱氮除磷研究。选用聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)和硫铁矿作为湿地系统的主要功能填料, 构建异养反硝化与自养反硝化相结合的混合营养反硝化系统。通过水质指标监测和高通量测序等手段, 探究工艺运行效果与微生物群落结构机制。构建 PHBV+硫铁矿组(实验组)和 PHBV+陶粒组(对照组), 反应器连续运行 77 天, 结果表明, 当水力停留时间(HRT)为 2 小时, 进水水质为 NO3−-N=8.39±1.72mg/L, TN=10.41±1.58mg/L, TP=0.37mg/L, COD=15.7mg/L 时, 平均出水 TN 浓度达到 2.22mg/L, TP 浓度达到 0.28mg/L, COD 浓度为 32.7mg/L, PHBV+硫铁矿组人工湿地脱氮效率(78.55%)明显优于 PHBV+陶粒组(51.25%), 基本上达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002) V 类。微生物群落结构分析表明, PHBV+硫铁矿组人工湿地中的优势菌属为自养菌 Desulfobacter 和异养菌 unclassified_k__norank_d__Bacteria, 丰度分别为 23.98%和 12.30%, 通过自养与异养菌的协同, 实现混合营养反硝化, 其中与硫代谢相关 Desulfobacter 主导的自养反硝化在系统脱氮中可能起主要作用。研究结果可为 PHBV+硫铁矿基人工湿地尾水生物脱氮除磷的工程实践提供参考。

关键词 人工湿地; 尾水; 固相碳源; 硫铁矿; 混合营养反硝化

近年来, 我国城镇污水处理厂尾水排放已普遍执行城镇污水处理厂污染物排放标准(GB 18918—2002)一级 A。随着水环境保护力度加大, 广东、北京、四川、安徽、湖北、天津、江苏以及浙江等省(市)纷纷出台比“一级 A”更严格的地方标准[1]。未出台地方标准的省市, 新增扩建和改建污水处理厂的环境影响评价批复也日益严格, 出水普遍需要达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002)IV 类, 尾水深度脱氮的需求日益迫切。常见尾水生物脱氮技术有反硝化滤池、反硝化移动床生物膜反应器和人工湿地等[2–4], 其中人工湿地具有耐冲击负荷能力强、建设成本低、运行管理简单和生态景观效果好等优点, 应用前景极为广阔。

尾水中 COD 浓度较低(20～40mg/L), TN 浓度较高(15～30mg/L), 以 NO3−-N 为主, C/N 比严重失衡, 导致反硝化难以进行。为提高尾水反硝化速率, 研究者往往添加碳源或无机电子供体[5–6]。常用的碳源有小分子液体碳源(甲醇、乙醇和乙酸钠)、天然纤维素类固体碳源(木屑、稻壳和玉米芯)以及可降解聚合物类固体碳源(聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)、聚己内酯(PCL)和聚乙酸(PLA))。姜应和等[7]将杉树皮作为湿地系统的反硝化碳源, 探究进水 NO3−-N 负荷对释碳速率和反硝化脱氮的影响, 对比树皮、腐朽木和玉米秆的释碳周期, 发现树皮的释碳速率最慢, 释碳周期最长, 缓释性能最佳。相较于液体碳源, 固体碳源不仅含碳量高, 而且表面粗糙, 微生物易于附着生长, 可以作为微生物的生长载体, 能显著地提高湿地系统的脱氮效率。但是, 天然纤维素类固体碳源的释放量不稳定, 可降解聚合物类固体碳源的成本较高[8]。常见的无机电子供体有铁基、硫基和硫铁基。董璐[9]对比 5 种不同基质的湿地系统, 发现以单质硫、单质铁、单质硫+单质铁为基质的湿地系统都有较好的 TN 去除效果, 但硫基湿地系统的硫酸盐污染水平较高, 铁基系统易氧化且污泥产量大。硫铁基系统内电子供体的浸出速率受水力停留时间(HRT)和 pH 等因素影响, 需要提供适宜的条件, 单独处理花费时间较长[10]。Chen等[11]发现添加香蒲凋落物可以在硫自养湿地系统内同时实现硫基自养和异养反硝化, 与完全异养反硝化相比, 硫基混合营养反硝化可以减少对有机碳的需求。Zhang 等[12]建立以硫铁矿和葡萄糖作为共电子供体的硫铁基混合营养反硝化系统, 对硝酸盐的去除率为 99.99%±0.01%, 反硝化速率显著地优于硫铁基自养反硝化系统。因此, 有研究者提出通过构建混合营养反硝化系统, 将碳源与无机电子供体结合起来, 既减少高成本碳源的添加量, 又保证系统较高的反硝化速率, 共同促进尾水脱氮[13–15]。

现有的研究普遍在实验室条件下进行, 进水多为模拟废水, 成分单一, 缺乏对真实尾水的研究。因此本研究拟构建混合营养反硝化型人工湿地, 将异养反硝化与自养反硝化相结合, 对实际污水处理厂尾水进行深度脱氮除磷处理。选取的固相碳源为PHBV, 无机电子供体为硫铁矿, 构建 PHBV+硫铁矿混合营养反硝化系统, 协同促进尾水脱氮除磷。同时, 利用高通量测序技术, 解析实际尾水条件下湿地内部微生物群落组成及丰度, 以期为 PHBV+硫铁矿基人工湿地尾水生物脱氮除磷的工程实践提供借鉴和参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

PHBV 和陶粒购自浙江省宁波市某生物材料有限公司, 硫铁矿购自安徽省铜陵市某矿产品有限公司, 平均粒径均为 4～5mm。砾石和石英砂购自麦播润(河南)环保科技有限公司, 粗砾石粒径为 50～ 70mm, 细砾石粒径为 10～20mm, 石英砂粒径为 1～2mm。湿地植物选取污水处理厂绿化植物鸢尾。

接种污泥为污水处理厂好氧段和缺氧段混合污泥。首先将污泥淘洗一遍, 去除大颗粒杂质, 然后沉降半小时, 倒掉上清液。接下来, 加水, 重悬浮污泥, 搅匀 5 分钟, 静置沉降 5 分钟, 然后迅速倒掉上清液。重复操作 3 次, 以便去除污泥中大部分无机组分, 保证污泥的活性。最后将两部分污泥混合, 即为本次投加需要的接种污泥。进水为新乡市某大型污水处理厂尾水, 进水 NO3−-N 浓度为 7.66±2.11mg/L, NO2−-N 和 NH4+-N 浓度几乎为零, TN 浓度为9.34±2.20mg/L, TP 浓度为 0.38±0.10mg/L, COD 浓度为 16.1±5.4mg/L, DO 浓度为 6.40±0.58mg/L, pH为 7.00±0.13, 水温为 26.9±1.3℃。运行时间为 2022年 7 月—10 月。

1.2 实验方法

实验装置为两组不同基质构建的垂直潜流人工湿地系统。模拟人工湿地系统示意图如图 1 所示。模拟人工湿地反应器为圆柱体结构, 高 100cm, 内径为 30cm, 有效容积为 60L(按有效高度 85cm计), 从下至上分别为 10cm布水区、承托层、80cm基质层和 10cm 超高区。按照填充基质类型不同, 基质层分为上中下 3 层: 上层均为 10cm 厚的石英砂层, 用来种植湿地植物; 下层为 30cm 厚的砾石承托层, 从下至上依次为 10cm 厚的粗粒石层和 20cm 厚的细砾石层; 中层为 40cm 厚的主体功能基质层。实验组模拟人工湿地主体功能基质层的组成为 PHBV +硫铁矿, 按照 1:2 的质量比混合填充。对照组主体功能基质层的组成为 PHBV+陶粒, 保证 PHBV 用量与实验组相同, 空余部分用陶粒混合填充。沿着反应器不同高度分布有水质取样口及基质取样口: 承托层右侧以上每隔 10cm 设置水质沿程采样点, 共 6 个, 并在承托层右侧以上75cm 处设置出水取样口; 承托层左侧以上 10cm 和40cm 处分别设置底部、中部基质取样口。反应器进水口为承托层左侧以下 5cm 处, 采用升流式的进水方式。

接种污泥后, 静态驯化一周。静置培养过程中,定期更换营养液(NO3−-N浓度为 25mg/L, PO43−-P 浓度为 5mg/L, N/P=5:1)。连续运行期间, 定期监测模拟人工湿地进出水的水质指标, 同时改变反应器进水流量(2, 12 和 30L/h), 探究不同 HRT 对人工湿地脱氮除磷效果的影响。第一阶段, HRT=30h, 连续运行至第 9 天; 第二阶段, HRT=5h, 连续运行至第36 天; 第三阶段, HRT=2h, 连续运行至第 77 天。在系统运行第 77 天, 对湿地系统沿程出水的水质指标进行监测。在反应运行后期第 80 天, 采集各组湿地中生物载体(砾石、PHBV+陶粒、PHBV+硫铁矿)的生物膜样品, 进行 16S rRNA 高通量测序分析。

1.3 分析方法

1.3.1水质分析方法

采集水样时, 原地检测其温度、pH 和溶解氧(DO), 然后经 0.45μm 滤膜过滤, 立即带回污水厂化验室, 检测 NO2−-N, NO3−-N, NH4+-N, TN, TP 和COD。测定方法如表 1 所示。

1.3.2微生物分析方法

打开两个人工湿地的基质取样口, 用无菌勺分别取砾石、PHBV+陶粒、PHBV+硫铁矿颗粒载体至无菌取样管中, 送到上海美吉生物医药科技有限公司进行 DNA 提取、PCR 扩增与产物纯化以及Illumina Miseq 测序。按 97%的序列相似性, 对非重复序列进行操作分类单位(opera-tional taxonomic unit, OTU)聚类, 在 3%水平上通过 Mothur v.1.30.2软件, 分别在门(Phylum)和属(Genus)水平上计算各样本的微生物群落组成。通过上海美吉生物医药科技有限公司的多样性云分析平台 Qiime2 流程进行微生物群落数据分析。每种样品包含 3 组生物学重复, 取平均值进行各种样品间的对比。

2 结果与讨论

2.1 两组湿地系统脱氮除磷效果对比

2.1.1 NO3−-N及TN的去除

图 2 显示两组人工湿地系统进出水 NO3−-N 的浓度变化情况, 图 3 显示 TN 浓度及去除率变化情况。可以看出, 系统进水 NO3−-N 浓度波动较大, TN浓度受其影响而变化。进水 NO3−-N 和 TN 浓度在第一阶段分别为 5.41±1.98 和 6.72±2.23mg/L, 第二阶段分别为 7.04±1.75 和 8.36±1.51mg/L, 第三阶段分别为 8.39±1.72 和 10.41±1.58mg/L。随着运行时间增长, 进水 NO3−-N 和 TN 浓度略有升高。

第一阶段, PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地出水 NO3−-N浓度分别为 2.34 和 1.14mg/L, 出水 TN 浓度分别为 3.68 和 4.00mg/L, TN 去除率分别为 44.41%和 35.44%。此时去除效果较差, 且出水有机物含量较高, 随后调节反应器进水流量, 缩短 HRT。

第二阶段, 两组人工湿地出水 NO3−-N 无明显差异, 平均浓度均低于 0.9mg/L, 此时反硝化效果较好, 出水 TN 浓度整体上较低, 分别为 1.75 和 1.68mg/L, 达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002) V类。如图 3 所示, 第二阶段的 TN 去除率明显上升, 最高达到 86%。与以往研究结果相似, PHBV 的添加为两组湿地系统提供了充足的碳源, 使其在较短HRT 下, 维持较高的 TN 去除率[16]。

第三阶段, PHBV+陶粒组人工湿地出水 NO3−-N 浓度为 3.48mg/L, 明显高于 PHBV+硫铁矿组的1.04mg/L。反硝化效果受 HRT 影响较大, 系统刚开始运行时 HRT 较长, 反应器内存在大量水解酸化细菌, 对添加的固体碳源 PHBV 进行分解利用, 碳源释放量高, 为反硝化提供充足的碳源, 此时 NO3−-N 的去除主要依靠异养反硝化细菌; 系统运行至第42 天, 随着 HRT 不断缩短, 系统内微生物丰度降低, 水解酸化细菌丰度随之降低, 碳源释放量明显下降, 异养反硝化细菌丰度也随之降低, 而 PHBV+硫铁矿组人工湿地内自养反硝化细菌占比开始上升, 自养反硝化逐渐发挥重要作用。

系统运行第 57～77 天, 随着 HRT 降低, 处理水量增大, TN 去除效果下降, 两组人工湿地出水 TN浓度分别为 6.11 和 2.26mg/L, 存在明显的差异。此时 PHBV+硫铁矿组人工湿地内存在混合营养反硝化作用, 硫铁矿的存在对异养反硝化产生协同促进作用, 对 NO3−-N 的去除效果比单一的异养反硝化作用更好, 因此 TN 去除率更高, 维持在 70%以上, 而 PHBV+陶粒组人工湿地的 TN 去除率低于 45%。

2.1.2 NH4+-N和NO2−-N的积累

图 4 显示两组人工湿地系统进出水 NH4+-N 和NO2−-N 浓度的变化情况。作为 NO3−-N 还原的副产物, NH4+-N 和 NO2−-N 的积累会在一定程度上影响反硝化效果[17]。由图 4 可知, 整个运行过程中湿地系统进水 NH4+-N 浓度比较稳定, 均低于 0.2mg/L, 在系统运行初期, 两组人工湿地出水 NH4+-N 浓度都较高, PHBV+硫铁矿组最高为 3.34mg/L, PHBV+陶粒组最高为 1.70mg/L。这一现象普遍发生在添加固体碳源的反应器中, 反应器运行初期, 碳源释放量过高, 内部进行厌氧反应, 硝酸盐异化还原为氨[18]。在系统运行 12 天后, 出水 NH4+-N 随着 HRT的缩短而明显下降, PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组平均浓度分别为 0.40 和 0.55mg/L, 均处于较低水平。通过图 4 发现, PHBV+硫铁矿组出水有机物含量更高, 可能存在更强的硝酸盐异化为氨(DN-RA)现象。类似的研究也表明, 电子供体充足或电子受体缺乏时候, NO3−-N 的还原均更偏向 DNRA 过程[19]。在湿地系统运行过程中, 进出水 NO2−-N 浓度几乎为零, 在系统运行末期出水 NO2−-N 略有升高, 但均低于 0.2mg/L, 并未出现 NO2−-N 的明显积累, 自养及异养反硝化过程得以顺利进行。

图 5 显示两组人工湿地系统进出水 TP 浓度的变化情况。第一阶段, 系统进水 TP 平均浓度为0.51mg/L, PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地出水 TP 浓度分别为 0.45 和 0.84mg/L。研究发现, 基于硫铁矿的生物处理技术, 可通过“生物驱动反硝化–非生物化学除磷”双途径实现氮磷的同步去除[20]。硫铁矿在生物、化学氧化过程中形成的无定形 Fe(OH)3 和 γFeOOH 等代谢产物具有高比表面积和正表面电荷, 可通过吸附沉淀去除污水中带负电性的磷酸根[21]。PHBV+硫铁矿组人工湿地内硫铁矿的添加, 可能使反应器在静置驯化培养期沉积了大量磷酸铁沉淀, 反应器刚开始进水时流量较小, 导致沉积在其内部的磷酸铁沉淀被缓慢冲出, 造成出水 TP 高于进水。随着进水流量加大, 系统内沉积的硫酸铁被全部冲出, 出水开始恢复正常。

第二阶段, 进水 TP 浓度为 0.34mg/L, 两组人工湿地出水 TP 浓度分别为 0.26 和 0.29mg/L。第三阶段, 进水 TP 浓度为 0.37mg/L, 两组人工湿地出水 TP 浓度分别为 0.32 和 0.28mg/L。反应器除磷效果不明显, 主要是污水厂通过投加除磷药剂聚合氯化铝进行化学除磷后, 尾水磷含量较低, 湿地系统很难进一步高效去除。二、三阶段相比, PHBV+陶粒系统除磷效率随 HRT 的缩短而下降, PHBV+硫铁矿系统则与之相反, 随着 HRT 的缩短而上升。PHBV+硫铁矿系统内硫铁矿的添加, 在促进自养反硝化脱氮的同时, 对磷也有一定的去除作用, 使得系统出水达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002) IV 类。

2.2 进出水COD, DO和pH比较分析

如图 6 所示, 运行过程中系统进水 COD 浓度较低, 为 16.1mg/L。系统运行的前两个阶段, 出水COD 浓度较高, 均高于 50mg/L, 刚开始运行时略有上升, 之后呈下降趋势, 随后趋于稳定, PHBV+陶粒组出水 COD 浓度明显低于 PHBV+硫铁矿组, 但仍处于较高水平。本研究中两组人工湿地 PHBV添加量相同, 但陶粒为异养反硝化细菌的生长提供了良好的生物载体[22], 更有利于充分利用水解酸化细菌分解 PHBV 产生的可溶性有机物; 硫铁矿为自养反硝化细菌提供了电子供体, 减少了释放碳源的使用量, 出水 COD 浓度相对较高。

第三阶段, 进水量继续加大, 系统内污染负荷升高, 碳源利用加强, PHBV+陶粒组和 PHBV+ 硫铁矿组出水 COD 平均浓度分别为 24.8 和 32.7mg/L, 达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002)V 类。PHBV+硫铁矿组人工湿地内 PHBV 和硫铁矿的混合添加, 成功地构建了混合营养反硝化系统, 在保证系统较高脱氮效率的情况下, 赋存更多的碳源, 具有长期稳定的反硝化脱氮潜力。有研究指出,固相碳源添加量对人工湿地反硝化脱氮具有显著的影响: 添加量<5.0%时, NO3−-N 去除率随碳源添加量的增大而增大; 添加量达到 5.0%时, NO3−-N去除率超过 95.0%; 碳源添加量>5.0%时, NO3−-N去除率基本上保持不变, 发生 NH4+-N 积累现象[23]。两组人工湿地运行过程中出水 COD 浓度均高于进水, 在不改变进水流量的前提下, 可以考虑减少高成本PHBV 的使用量, 降低成本投入, 同时避免副产物的产生, 进一步提高出水的水质。

由图 7 可知, 由于水厂二沉池的出水跌差较大, 尾水富氧严重, 反应器进水 DO 浓度为 6.40mg/L。有研究发现, 反硝化反应的 DO 含量应保持在 0.5mg/L 以下, 高于此值会抑制反硝化过程[24]。本研究中进水 NH4+-N 几乎为零, 系统内不发生硝化作用, 无法利用进水 DO。当水中 DO 含量过高时, 需要通过好氧微生物消耗尾水中原本就不足的有机物来去除, 不利于反硝化脱氮。PHBV+陶粒组和PHBV+硫铁矿组人工湿地内PHBV的添加, 突破了氧气的限制, 既为好养微生物提供了充足的有机物, 使得系统内 DO 快速下降, 出水平均浓度分别达到0.47 和 0.59mg/L, 基本上满足反硝化所需条件, 又为异养反硝化细菌提供电子供体, 提高脱氮效率, 与此同时, 异养反硝化产生的无机碳源为自养反硝化提供营养, 形成协同促进效应[25]。

如图 8 所示, 系统进水 pH 较为稳定, 平均为7.0。第一阶段, PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地的出水 pH 较低, 分别为 5.64 和 5.43。第二阶段, 两组湿地系统出水 pH 先略有下降, 之后缓慢上升, 与 COD 变化趋势相反。第三阶段, 两组湿地系统出水 pH 趋于稳定, 平均值均为 6.85。静置培养期间, 系统内微生物大量繁殖, 污泥浓度高, PHBV 降解菌快速富集, 水解产酸, 使系统维持弱酸环境。随着反应的不断进行, 系统内反硝化细菌的丰度升高, 生物膜逐渐成熟, 好氧异养菌与反硝化细菌共同作用于 PHBV, 使出水 COD 浓度下降, 异养产碱, 使 pH 上升, 维持中性条件, 反应系统趋于稳定。Ge 等[26]发现利用硫铁矿作为人工湿地载体基质可以提高 TN 去除率, 对 COD 和 NH4+-N 的去除没有不利影响, 但该研究中 HRT=72h, 且需添加石灰石来补充碱度。本研究中, PHBV+硫铁矿组人工湿地内 PHBV 的添加促进了异养反硝化, 生成一定的碱度, 供给自养反硝化, 形成混合营养反硝化体系, 在较短 HRT 下, 保持较高的脱氮效率, 并维持系统内酸碱平衡, 无需额外添加酸或碱。同时, 中性条件也有利于微生物生长繁殖, 保证反硝化过程顺利进行。

2.3 两组湿地系统沿程出水脱氮效果对比

PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地沿程出水 NO3−-N, NO2−-N, NH4+-N 和 TN 浓度变化如图 9 所示, 人工湿地系统进水 NO3−-N, NO2−-N, NH4+-N 和 TN 浓度分别为 7.68, 0.00, 0.17 和 9.89mg/L, 以 NO3−-N 为主。PHBV+陶粒组人工湿地出水 NO3−-N, NO2−-N, NH4+-N 和 TN 浓度分别为 5.98, 0.17, 0.31 和 7.11mg/L, NO3−-N 去除率较低, 脱氮效果较差。PHBV+硫铁矿组人工湿地出水 NO3−-N, NO2−-N, NH4+-N 和 TN 浓度分别为 1.78, 0.06, 1.10和 2.86mg/L, NO3−-N 去除率高, 出水 NH4+-N 明显积累, 整体脱氮效果好, 与第三阶段长期运行效果一致。沿水流方向, 从底部砾石层到中部功能填料层再到上部石英砂层, 出水 NO3−-N 和 TN 浓度降低, NH4+-N 浓度升高。

PHBV+陶粒组人工湿地沿程各取样口的水质变化情况较稳定, 在反应器高度 30～40cm 处, NO3−-N 去除速率略有加快, NO2−-N 明显开始积累。这一高度正是功能填料层, 小粒径 PHBV 和陶粒的添加为湿地系统补充碳源, 提供更大面积的微生物附着载体, 使系统脱氮效率加快。Jia 等[27]以可降解聚合物类共混物 PHBV/PLA作为水平潜流人工湿地的反硝化固体碳源, 脱氮效率明显高于只添加陶粒的湿地系统, 反硝化反应主要发生在固体碳源填充区, 该区域富集了与反硝化有关的功能微生物 Rhodo-cyclaceae 和 Bacteroidetes, 表明将可生物降解聚合物作为人工湿地反硝化碳源是可行的。但是, 由于该阶段人工湿地系统进水流量较大, HRT 较短, 污染负荷较高, 反硝化所需碳源相对不足, 脱氮效果不好。

PHBV+硫铁矿组人工湿地在反应器高度 20～40cm 处的 NO3−-N 去除速率明显加快, 这一高度正是细砾石层与功能填料层交界处, PHBV 的添加为湿地系统补充碳源, 硫铁矿的添加使自养反硝化得以进行, 两者相互协同, 构建混合营养反硝化体系, 共同促进尾水深度脱氮。在反应器高度 40cm 处, 出水 NH4+-N 明显开始积累, 出水 TN 浓度逐渐下降, 但随着高度的增加, 下降速度明显变缓。

PHBV+硫铁矿组人工湿地中, 硫铁矿的添加为自养反硝化提供了电子供体, 促进自养反硝化过程。自养反硝化过程消耗水中碱度, 有利于水解酸化细菌的生长, 进一步分解 PHBV。PHBV 的分解为异养反硝化提供了充足的碳源。异养反硝化又为自养反硝化提供了无机碳源与碱度, 促进自养反硝化的进行。这一系列反应过程相互促进, 共同导致PHBV+硫铁矿组人工湿地更好的脱氮效果。

2.4 湿地填料表面微生物群落分析

2.4.1两组湿地系统不同填料表面微生物群落丰度和多样性

为了解 PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地内不同填料表面的微生物群落丰度及多样性, 运用 Mothur 对各样品的微生物群落丰度和多样性指数(Ace, Chao1, Shannon和 Simpson)及测序深度指数 Coverage 进行计算和比较。两组湿地系统底部细砾石层和中部功能填料层的微生物丰度和多样性指数如表 2 所示。

Ace 和 Chao1 指数都可以用来估计群落中的OTU 数目。OTU 数目越多, Ace 指数越大, 说明群落的物种类别丰度越高; Chao1 指数越大, 表明该样本的物种数目较多[28]。如表 2 所示, 两组湿地系统内底部细砾石的 Ace 和 Chao1 指数都比中部功能填料层高, 说明反应器底部的群落物种总数较多。这可能与本研究的进水有关, 尾水成分复杂, 内部含有大量微生物, 进入反应器后在底部砾石表面附着, 而中部功能填料层由于 PHBV 和硫铁矿等功能填料的添加, 使反硝化脱氮优势菌种富集, 群落物种总数下降。由表 2 可知, 各样品的 Coverage 值均超过99.6%, 说明此次测序结果能代表样本的真实性。

Shannon 指数可以综合分析群落丰度和均匀度, 该指数越高, 说明群落的多样性越高, 物种分布越均匀。Simpson 指数也用来估算样品中微生物的多样性, 但该指数越高, 表明群落多样性越低。从表 2 发现, 类似于群落丰度, 两组湿地系统反应器底部的群落多样性也更高, 进一步表明尾水成分的复杂性。反应器中部的群落多样性下降, 可能是由于少数物种在群落中具有较高的丰度, 如反硝化脱氮优势菌种富集, 使群落整体的均匀度下降。

通过对比两个反应器中部的功能填料, 发现实验组的丰度指数 Ace 和 Chao1 相对更低, 多样性Shannon 指数则较高(Simpson 指数较低), 表明实验组由于 PHBV 和硫铁矿的添加, 多种反硝化脱氮优势菌种富集, 在保证系统群落丰度的同时, 可以维持系统内较高的物种均匀度, 从而增加物种的生物多样性, 形成混合营养反硝化。对照组 PHBV 和陶粒的添加, 只为异养微生物提供营养和更多的附着场所, 虽然维持了较高的群落丰度, 但系统内物种均匀度明显下降。PHBV+硫铁矿组人工湿地内, PHBV 和硫铁矿的添加在强化多种反硝化脱氮优势菌群富集方面效果显著, 使系统内维持较高的生物多样性, 有利于维持系统稳定, 耐冲击负荷能力更强, 反硝化脱氮效果更稳定。

2.4.2门分类水平下微生物群落组成

对 PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地内不同填料表面的微生物群落进行高通量测序, 门水平下的微生物群落结构和相对丰度分析结果如图10 所示, 其中 others 代表剩余菌门的相对丰度总和。可以发现, 两组湿地系统底部细砾石层的微生物群落组成结构相似, 主要由 Proteobacteria, Firmi-cutes, Chloroflexi, Acidobacteriota 和 Actinobacteriota等 18 个菌门构成。其中, Proteobacteria 占据绝对优势, 远高于其他菌门, 与李娟红等[29]的研究结果相似。Proteobacteria 可以在复杂环境中生存, 具有代谢多样性, 在污水处理中发挥重要作用[30]。

两组湿地系统中部功能填料层的微生物群落组成有明显差异。对照组中, unclassified_k__norank_ d__Bacteria(36.99%)占据绝对优势, 其次是 Firmi-cutes(19.35%), Proteobacteria(17.37%)和 Bacteroi-dota(7.03%), 其余菌门均低于 5%。实验组中, Des-ulfobacterota (31.44%)占据绝对优势, 其次是 Bac-teroidota (13.35%), Proteobacteria (12.91%), unclassi-fied_k__norank_d__Bacteria (12.30%), Firmicutes(8.57%)和 Caldisericota (8.09%), 其余菌门均低于5%。

unclassified_k__norank_d__Bacteria 在对照组中大量存在, 这一现象在以往研究中也有发现。随着实验天数增加, unclassified_k__norank_d__Bacteria 在反应器的微生物群落组成占比明显升高[14]。马香菊[31]发现 unclassified_k__norank_d __Bacteria 是同时具备 bamoA 基因的硝化菌和 nir 基因的反硝化菌的共有细菌门, 可以同步进行硝化作用和反硝化作用。Firmicutes 和 Proteobacteria 是添加固相碳源的反硝化系统中常见的两类菌门, Firmicutes 可以产生纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶等多种胞外酶, 这些酶有助于固体碳源的水解, 使其被 Proteobacteria 中与脱氮有关的微生物利用, 协同促进异养反硝化脱氮[18]。Bacteroidetes 在中部功能填料层的比例明显升高, 有研究表明 Bacteroidetes 菌门包括拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲, 其中鞘脂杆菌纲的重要类群为噬胞菌属, 它可以降解纤维素[32], 可能对PHBV 水解起重要作用。Desulfobacterota 在实验组大量存在, 表明 PHBV+硫铁矿组湿地系统内硫酸盐还原菌门的富集, 硫酸盐还原菌能够在缺氧条件下, 以有机物为电子供体, 将硫酸盐还原为硫化物, 促进系统内硫和氮循环, 有利于降低反应器出水硫酸根浓度[12,33]。

2.4.3属分类水平下微生物群落组成

属分类水平下 PHBV+陶粒组和 PHBV+硫铁矿组人工湿地内不同填料表面的微生物群落热图分析结果如图 11 所示。可以看出, 两组湿地系统底部细砾石层的优势菌属与中部功能填料层的优势菌属存在明显差异, 且不同湿地系统同层填料表面的优势菌属也不尽相同。底部细砾石层中, 对照组的优势菌属为 Hyphomicrobium (6.43%), norank_f__JG30-KF-CM45 (4.03%)和 Clostridium_sensu_stricto_13 (3.96%), 实验组则是 Azotobacter (8.60%), Hypho-microbium(4.26%), norank_f__norank_o__1013-28-CG33(4.02%), unclassified_o__Burkholderiales (3.99%) 和 Thiobacillus (3.32%)占优势地位。中部功能填料层中, 对照组的优势菌属为 unclassified_k__norank_ d__Bacteria (36.99%), unclassified_f__Sporomusa-ceae (6.23%)和Telmatospirillum (5.71%), 实验组则是 Desulfobacter(23.98%), unclassified_k__norank_d__ Bacteria (12.30%), Caldisericum(8.08%)和 norank_f__ Bacteroidetes_vadinHA17 (5.63%)占优势地位。对比两组湿地系统填料表面微生物的优势菌属组成可以发现, 硫铁矿的添加不仅改变了中部功能填料层的微生物群落结构, 对底部细砾石层的微生物群落结构也产生一定的影响。

Hyphomicrobium 是较为典型的真正反硝化菌, 在污水厂活性污泥中占比较高, 体内拥有一整套反硝化还原酶, 因此在污水处理中不易检测到 NO2−-N 的累积[34]。Azotobacter 是氮循环中的关键微生物, 它能利用难降解的芳香族化合物, 对污水中油污和农药等难降解物质有一定的去除作用, 可以调控微生物群落[35]。unclassified_k__norank_d__Bac-teria 可能同时具有硝化和反硝化功能, 对湿地系统内氮的去除起重要作用, 并且可以减少温室气体N2O 的排放。Zhang 等[36]发现, 反硝化过程中 N2O排放量随其丰度的增加而显著降低。Desulfobacter是一种硫酸盐还原菌, 能够利用碳源作为电子供体, 将硫酸根作为电子受体, 在 COD 去除和硫酸盐生物还原过程中发挥重要作用[37]。高丰度的硫酸盐还原菌的存在证明 PHBV+硫铁矿系统内存在硫循环过程, 该过程不断地为反硝化过程提供电子供体, 从而极大地提升了功能基质脱氮性能。因此, 推测Desulfobacter 在硫铁矿的表面附着, 并参与硫铁矿内硫自养反硝化。norank_f__Bacteroidetes_vadin-HA17 可将有机物降解为乙酸、丙酸、H2 和 CO2[38], 有利于湿地系统内 PHBV 的水解, 为反硝化提供营养物质。综上所述, PHBV+硫铁矿组人工湿地内硫铁矿的添加使系统内富集了更多的菌属, 异养反硝化与自养反硝化相互促进, 实现混合营养反硝化。研究结果揭示了 PHBV+硫铁矿组人工湿地高效脱氮的内在微生物机制, 其中与硫代谢相关 Desulfo-bacter 主导的自养反硝化在系统脱氮中可能起重要作用。

3 结论

1)在HRT=2h运行条件下, PHBV+硫铁矿组人工湿地脱氮效率(78.55%)明显优于 PHBV+陶粒组(51.25%), 平均出水 TN 浓度达到 2.22mg/L, TP 浓度达到 0.28mg/L, COD 浓度为 32.7mg/L, 基本上达到地表水环境质量标准(GB 3838—2002) V 类。

2)湿地系统内 PHBV 的添加为好养微生物提供充足的有机物, 使系统内 DO 维持在较低水平, 为异养反硝化细菌提供有机电子供体, 满足反硝化所需条件, 提高脱氮效率。PHBV+硫铁矿实验组硫铁矿的添加, 为自养反硝化提供无机电子供体, 减少高成本 PHBV 的使用量, 在保证系统较高的脱氮效率下, 赋存更多的碳源, 具有长期稳定的反硝化脱氮潜力。水解酸化为异养反硝化提供有机碳源, 异养反硝化为自养反硝化提供无机碳源, 水解产酸, 异养产碱, 自养产酸, 共同维持系统稳定, 形成协同促进效应。

3) PHBV+硫铁矿组人工湿地中, 由于自养菌Desulfobacter(23.98%)和异养菌 unclassified_k__ norank_d__Bacteria (12.30%)的存在, 实现了混合营养反硝化。研究结果揭示了 PHBV+硫铁矿组人工湿地高效脱氮的内在微生物机制, 其中与硫代谢相关 Desulfobacter 主导的自养反硝化在系统脱氮中可能起主要作用。

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Mixotrophic Denitrification of Actual Tail Water from Wastewater Treatment Plant Treated by PHBV-Pyrite Based Constructed Wetlands

1. School of Ecology and Environment, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001; 2. College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871; † Corresponding authors, E-mail: wzwu@pku.edu.cn (WU Weizhong), chxing@zzu.edu.cn (XING Chuanhong)

Abstract Taking the tail water of a large wastewater treatment plant in Xinxiang city, Henan Province of China, as the research object, the deep nitrogen and phosphorus removal by constructed wetlands (CWs) for this tail water was studied. Polyhydroxybutyrate valerate (PHBV) and pyrite were selected as the main functional fillers of wetland system to construct a mixotrophic denitrification system by combining heterotrophic denitrification and autotrophic denitrification. Water quality index monitoring and high-throughput sequencing technology were used to explore the removal performance and microbial community structure. The PHBV+pyrite experimental group and PHBV+ ceramite control group were set up for continuous operation for 77 days. Results show that when hydraulic retention time (HRT) was 2 hours, NO3−-N, TN, TP and COD concentration are 8.39±1.72 mg/L, 10.41±1.58 mg/L, 0.37 mg/L and 15.7 mg/L, respectively, the average effluent TN concentration reaches at 2.22 mg/L, TP concentration reaches 0.28 mg/L and COD concentration is 32.7 mg/L. The nitrogen removal efficiency of CWs in PHBV+ pyrite group (78.55%) is obviously better than that in PHBV+ceramite group (51.25%), basically meeting the surface water environmental quality standard (GB 3838–2002) Class V. Analysis of the microbial community structure shows that the PHBV + pyrite group advantage bacterium in artificial wetland are autotrophic bacteria Desulfobacter and heterotrophic bacteria unclassified_k__norank_d__Bacteria, the abundance are 23.98% and 12.30% respectively. Mixotrophic denitrification is achieved through coordination of autotrophic and heterotrophic bacteria, in which autotrophic denitrification led by Desulfobacter related to sulfur metabolism may play a major role in systematic nitrogen removal. These results can provide reference for the engineering practice of biological nitrogen and phosphorus removal in tail water of PHBV+pyrite-based CWs.

Key words constructed wetland; tail water; solid carbon source; pyrite; mixotrophic denitrification