BH:白河(32.83°N, 110.11°E); DJKBX:丹江口坝下(32.51°N, 111.51°E); TC:陶岔(32.66°N, 111.66°E); XY:襄阳(32.03°N, 112.15°E); XT:仙桃(30.38°N, 113.45°E); JJZ:集家嘴(30.57°N, 114.23°E)
图1 研究区域采样点
Fig. 1 Sampling points in the study area
北京大学学报(自然科学版) 第59卷 第2期 2023年3月
Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 59, No. 2 (Mar. 2023)
doi: 10.13209/j.0479-8023.2023.003
国家自然科学基金(41907203)和中国博士后科学基金(2021T140010)资助
收稿日期: 2022–03–02;
修回日期: 2022–09–23
摘要 为探究水体和沉积物潜在致病性细菌群落的物种组成及其分布特征, 为汉江致病菌防控提供基础数据, 于 2014 年春、秋两季, 在汉江 6 个监测断面进行样品采集。基于 16S rRNA Illumina Miseq 高通量测序技术, 利用 FAPROTAX 软件, 对细菌群落进行致病性功能预测, 共识别出 6 类致病菌, 隶属 6 门 9 纲 22 目45 科 105 属。研究结果显示, 变形菌门是汉江致病菌群落的主要组成物种, 占比高达 96.56%, Methylopu-milus和Roseomonas是属水平的优势物种。多样性分析结果表明沉积物中致病菌比水体中更丰富, 浮游群落随季节的变化更显著。环境因子相关性分析结果指示底栖群落对环境因子变化更敏感。零模型分析结果揭示随机过程主导水体和沉积物致病菌群落的构建。
关键词 汉江; 致病性细菌; 群落组成; 分布特征; 构建机制
病原微生物是水环境中常见的污染物, 具有易传染、易扩散的特性, 严重地威胁着生态环境, 对人体健康造成重大风险[1], 是影响水质指标的重要因素之一[2]。水生病原微生物可分为细菌、病毒和原生动物 3 种类型[3]。致病性细菌会引发动植物多种疾病, 导致全球流行性疾病爆发。水体污染是致病菌生存和传播的主要途径。作为一种指示生物, 大肠杆菌虽然可以用来检测水体病原微生物的污染情况[4], 但由于指示生物本身没有致病性, 并且在数量上与病原微生物不存在明显的线性关系[5], 所以大肠杆菌等指示生物不足以客观地反映水体中致病菌的种类和数量, 不能全面地评估水质质量[6]。因此, 有必要使用高通量测序技术, 对水环境中的致病菌展开全面、深入的研究, 预防水体致病性细菌的污染, 保护人类健康[6]。Zhou 等[7]选取珠江为研究区域, 探究河流浮游态致病性细菌群落的多样性, 结果显示动物寄生菌、人体致病菌和胞内寄生菌是细菌群落中具有致病特性的主要类群, 珠江水体中的致病性细菌主要由变形菌门和衣原体门组成, 在群落构建过程中随机过程起决定性作用。
汉江是长江最大的支流, 流经陕西、湖北两省, 是长江经济带的重要组成部分。汉江是襄阳等城市生活用水和工农业用水的重要水源地, 在国家水资源配置中发挥着重要作用。水质安全一直是备受关注的问题。然而, 受自然条件和人为干扰的影响, 汉江流域水污染现象日益突出。当前的研究集中在汉江上游区域底栖动物群落结构特征、水沙变化和污染物, 以及中下游区域水华等其他方面[8], 针对汉江整体浮游和底栖致病菌群落的物种组成及其分布特征分析的研究鲜有报道, 对致病菌群落结构的控制机制尚不清楚。
本研究采用高通量测序技术, 基于 16SrRNA 测序, 分析汉江中下游河段不同介质和不同季节致病菌群落的物种组成及其分布特征, 探究空间和环境变量对群落的影响, 定量地评估各种生态过程在群落构建中的贡献。
参照长江流域国家水文监测站的位置, 设置 6个采样点(图 1)。分别在春季(2014 年 3 月)和秋季(2014 年 10 月)同步采集每个断面的水体和沉积物, 共 24 个样品。在同一采样断面使用采泥器采集表层沉积物样品作为泥样, 在河道三线九点使用采水器取水作为水体样品。根据不同季节和介质, 将样品划分为 4 组: SS (春季底泥)、SW (春季水体)、FS (秋季底泥)、FW (秋季水体)。
对 24 个样品进行 DNA 提取: 先使用 FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 美国)试剂盒, 按照配套说明书提取样品的 DNA; 再使用 0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳实验, 检测 DNA 的完整性;最后利用 NanoDrop 分光光度计(NanoDrop Techno-logies Inc., Wilmington, DE, USA)测定样品 DNA 的质量和浓度。春季白河沉积物(BH_SS)样品和秋季襄阳沉积物(XY_FS)样品多次提取 DNA 失败。对剩余 22 个 DNA 样品进行后续测序和数据分析。
BH:白河(32.83°N, 110.11°E); DJKBX:丹江口坝下(32.51°N, 111.51°E); TC:陶岔(32.66°N, 111.66°E); XY:襄阳(32.03°N, 112.15°E); XT:仙桃(30.38°N, 113.45°E); JJZ:集家嘴(30.57°N, 114.23°E)
图1 研究区域采样点
Fig. 1 Sampling points in the study area
使用水质多功能检测仪, 现场测定水体样品的水温(TW)、pH 和溶解氧(DO)。SO42− (硫酸根浓度)、SS (悬浮物浓度)、CODMn (化学需氧量)、NO3− (硝酸氮浓度)、TN (总氮)、NH3-N (氨氮)、TP (总磷)、THRD (硬度)、F− (氟离子)、Q (流量)、COND(电导率)、BOD5 (生化需氧量)和 Cl− (氯离子)等均按国家标准方法测定。
为提高数据质量和分析结果的准确性, 先使用FASTP[9]对原始数据进行过滤。借助 QIIME2 (ver-sion 2021.8)[10]软件, 用 Deblur 方法对原始数据进行去噪, 聚类后获得 12317 个 ASVs。基于 SILVA 数据库[11], 使用 RDP classifier 进行物种注释[9,12]。FAPROTAX (Functional Annotation of Prokaryotic Taxa)[13]是一个对原核生物进行功能注释的软件, 使用该软件对细菌群落进行致病性功能(如动物寄生菌、人体致病菌、肺炎菌、腹泻菌、医源性人体致病菌和胞内寄生菌等)预测。某些致病菌可能兼具多种致病性功能, 提取至少具备一种潜在致病性功能的 ASVs, 组建群落进行后续分析。经过以下3 个步骤确定 ASVs 是否属于潜在致病菌: 1)基于SILVA 数据库(https://www.arbsilva.de/), 采用朴素贝叶斯模型(RDP 2.2 版本), 对具有代表性的序列进行分类, 置信阈值为 0.8～1; 2)使用 FAPROTAX 对每类代表性的 ASV 进行致病性功能预测, 将具有潜在致病性的类群划分到特定组别中; 3)提取至少属于上述一个致病菌类群的 ASV, 并组建潜在致病菌群落。
使用 R 软件(V3.6.1)的 vegan 包计算 Shannon 指数和 Chao1 指数, 评估潜在致病菌群的 α 多样性。使用 one-way ANOVA 计算多样性指数和 6 类致病菌相对丰度的组间差异。用非度量多维尺度(NM-DS)方法分析潜在致病性细菌群落的时空分布格局。使用多元方差(Adonis)分析法检验春季沉积物、春季水体、秋季沉积物和秋季水体样品群落的组间差异。使用 ggcorR 软件包进行 Mantel 分析, 检验不同类型样品潜在致病菌群落的 β 多样性指数与环境因子的相关性[14]。
利用 R 软件的 picante, ecodist 和 ape 软件包, 基于零模型分析, 评估各种生态过程在群落构建中的相对作用。先用系统发育树, 计算 βNTI 和 RCbray 指数。如果 βNTI>2, 表明异化选择过程(variable selection)主导群落的构建[15]; 如果 βNTI<−2, 表明同化选择过程(homogeneous selection)在群落构建过程中起重要作用[16]; 如果|βNTI|<2, 则进一步计算RCbray 值。当 RCbray>0.95 时, 认为扩散受限过程(dispersal limitation)控制群落的构建; RCbray< −0.95 时, 认为同质化扩散过程(homogenizing dis-persal)在群落构建过程中更重要; |RCbray|<0.95 时, 则认为无非主导过程(undominated process, 主要由弱选择、漂变(ecological drift)以及扩散等过程组成)驱动群落的构建[16–17]。
对 22 个样品测序, 共得到 45090 条高质量序列, 按最小样本序列数 7082 抽平, 共得到 148722条有效序列。使用 FAPROTAX 对 ASVs 丰度表进行物种功能预测。其中, 857 个 ASVs 的 3457 条序列被聚类到 6 类潜在致病菌类群中, 分别为动物寄生菌(animal parasites or symbionts, APS)、人体致病菌(human pathogens all, HPA)、肺炎菌(human pa-thogens pneumonia, HPP)、胞内寄生菌(intracellular parasites, InP)、医源性人体致病菌(human patho-gens nosocomia, HPN)和腹泻菌(human pathogens diarrhea, HPD), 序列数分别为 3173, 3120, 2813, 317, 21 和 4。
APS, HPA 和 HPP 是致病性细菌群落的 3 种优势类群, 数量级远大于其他类群。如图 2 所示, 从不同介质比较, 沉积物中的 APS 和 HPA 更丰富, 水体中的 HPP 含量高。在季节变化上, 高丰度的 3 类优势致病菌中, 有两类(APS 和 HPA)呈现秋季高于春季的趋势。
潜在致病菌群落的组成特征为 6 门、9 纲、22目、45 科、105 属和 66 种。如图 3 所示, 6 个门依次为变形菌门(Proteobacteria, 96.46%)、拟杆菌门(Bac-teroidetes, 1.54%)、衣原体门(Chlamydiae, 0.31%)、厚壁菌门(Firmicutes, 0.28%)、疣微菌门(Verruco-microbia, 1.11%)和 WPS-2 (0.27%)。丰度最高的3 个属为 Candidatus Methylopumilus (31.68%)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas, 10.21%)和一个未被培养的属 (11.56%), 这 3 个属的物种占比达 53.45%, 是该群落中的优势物种。为探究门级物种对各类致病菌的贡献, 分析 6 个门与 6 类致病菌的关系, 结果如图 4(a)所示。Proteobacteria 门是 5 类致病菌 APS (97.70%), HPA (99.36%), HPN (100%), HPP (99.82%)和 Inp (88.64%) 的主要组成物种, HPD (100%)全部来自 Bacteroidota 门, Verrucomicrobiota 门对 InP 的贡献 (11.35%)也很大。
图 2 优势类群在4组样品(秋季沉积物、秋季水体、春季沉积物和春季水体)中的含量
Fig. 2 Concentrations of dominant groups in four types of samples (autumn sediment, autumn water, spring sediment, spring water body)
图3 潜在致病菌的物种组成
Fig. 3 Composition and functional distribution of the potentially pathogenic bacteria in the Pearl River
如图 4(b)所示, 与底栖群落相比, 浮游态致病菌群落的 α 多样性随季节的波动更明显, 表现为秋季的群落丰富度和均匀度更高。从不同介质来看, 底栖和浮游群落的 α 多样性只在春季呈现显著差异(ANOVA, p<0.05)。
由于人类活动的影响, 沉积物致病菌的含量会随污染物的累积而增加, 随着时间推移, 会呈现底栖物种丰度更高, 分布更均匀的趋势。在季节上, 春季水温(春季: 9.6±1.0ºC; 秋季: 20.2±1.3ºC)和总氮偏低(春季: 1.5±0.2mg/L; 秋季: 1.8±0.8mg/L), pH偏高(春季: 8.1±0.3; 秋季: 6.9±0.3), 不适于致病菌的生存和繁殖, 所以春季水体的 α 多样性更低。变形菌门是汉江致病菌群的主要组成物种, 该群落的3 个优势属 Methylopumilus, Roseomonas 和一个未被培养的属均隶属于变形菌门。
(a)图中, 圆形的大小代表不同类群物种序列(reads)数的对数值(log10(x+1))
图4 潜在致病菌群与门级别细菌关系(a)以及群落α多样性的组间差异比较(b)
Fig. 4 Relationships between the potentially pathogenic groups and taxonomic taxa at genus level (a) and comparison of inter-group differences in α diversity of communities (b)
为研究汉江致病菌群落的分布特征及变化规律, 进行 NMDS 分析和 Adonis 分析。图 5 显示, 沉积物和水体的样品分别聚在一起, 两组组内的微生物群落具有较高的相似性。所以, 在汉江生态系统中, 介质类型是影响潜在致病菌群落结构的首要因子。同时, 在水体样品中, 秋季与春季的样品可以区分开, 说明季节对浮游态致病菌群落结构也有影响。沉积物没有相似的规律, 春季和秋季样品没有明显的界线, 表明底栖群落结构季节差异小。这是因为影响水体致病菌生长的环境因素(如温度、pH值、硝酸氮和总磷等)随季节变化较大[18], 而沉积物的相对稳定性导致其受这些环境因子的影响较小, 所以沉积物致病菌群落的季节差异性相对较小[19]。Adonis 分析结果(SW-FW, SW-SS 和 FW-FS: p<0.05; SS-FS: p>0.05)验证了上述结论。
图5 致病菌群落的季节和介质差异的NMDS分析
Fig. 5 NMDS analysis of seasonal and medium differences of potential pathogenic bacterial communities
为检验群落结构和环境因子的相关性, 本研究对不同季节和介质的致病菌群落与 16 个环境因子进行 Mantel 分析, 结果如图 6 所示。不同环境因子对不同类型样品群落的影响作用不同。秋季底栖和浮游态群落分别与温度(T)、NO3和 THRD 显著相关。春季底栖群落与 SO42−, SS, CODMn 和 pH 显著相关 (p<0.05), 春季浮游态群落与 NO3−和 TN 显著相关(p<0.05)。不同类型样品的致病菌对不同环境因子有不同的反应。
尽管温度在空间尺度上的变化不会太大, 但会显著地影响群落结构, 说明温度的波动关系到致病菌能否在自然环境中良好地生存和繁殖[20]。另外, 温度还可能影响致病菌的毒性[21–22]。对于其他某些环境因子(如 NO3−等), 其浓度的增加可能是由于富营养污水的排入, 这些污水中通常含有大量致病菌[18]。当然, 环境因子也会通过生物间的相互作用控制致病菌的群落结构[23]。
线条宽度代表对应的 Mantel’s r值, 颜色表示统计结果的 p值, 其中蓝色代表极相关(p<0.01), 红色代表显著相关(0.01<p<0.05), 灰色代表相关性不显著(p>0.05)
图6 环境因子对潜在致病菌群落影响的Mantel检验
Fig. 6 Mantel test of the influence of environmental factors on potential pathogenic bacterial communities
图7 汉江潜在致病菌群落构建机制的量化分析
Fig. 7 Quantitative analysis of the community construction mechanism of potential pathogenic bacteria in the Hanjiang River
为进一步探究汉江潜在致病菌群落的构建机制, 本文使用零模型评估各种生态过程在群落构建中的相对贡献, 结果如图 7 所示。浮游态和底栖致病菌群落的构建主要由随机过程控制, 无主导过程是汉江潜在致病菌群落构建的主要控制因素, 对底栖和浮游态群落构建的贡献分别为 95.6%和 86.3%。扩散限制对群落构建的作用在从水体到沉积物的垂向空间上呈现递增趋势, 说明随机过程会随着污染物积累效应的增加而增加。异化选择过程对构建致病菌群落的影响作用较小, 对浮游态群落(9.1%)的影响大于底栖群落(4.4%)。总而言之, 在汉江生态系统中, 随机过程对潜在致病菌群落的影响大于环境选择作用。类似地, Zhou 等[7]对珠江的研究发现, 随机过程在致病菌群落的构建过程中起主导作用, 表明不同河流中致病菌群落的构建机制存在共性, 启示我们在致病性细菌的防控中应重视随机过程的影响。
本文基于 16S rRNA Illumina Miseq 高通量测序技术, 利用 FAPROTA 软件, 分析汉江致病性细菌群落的物种组成及其分布特征。汉江细菌群落中的857 个 ASVs 的 3457 条序列被识别为具有潜在致病性, 这些物种分别归属于动物寄生菌(APS)、人体致病菌(HPA)、肺炎菌(HPP)、胞内寄生菌(InP)、医源性人体致病菌(HPN)和腹泻菌(HPD) 6 种类群。其中, APS, HPA 和 HPP 是致病性细菌群落的 3 种优势类群, 数量级远大于其他类群。这 3 类致病菌的物种丰度随季节波动较小, 在不同介质中分布较均匀。致病菌群主要由变形菌门的物种组成(96.46%), 3 个优势属 Candidatus Methylopumilus (31.68%), Ro-seomonas (10.21%)和 uncultured (11.56%)均隶属变形菌门。与底栖群落相比, 季节对浮游态致病菌的影响更明显, 秋季呈现更高的 α 多样性。NMDS 分析结果表明样品类型(介质差异)是影响群落的首要因子, 季节对底栖群落的影响不明显, 但对水体群落有显著的影响。Mantel 分析结果指示, 对于不同介质和不同季节的致病菌群落, 有显著影响的环境因子不同。对秋季底栖和浮游态群落有显著影响的环境因子分别是温度、NO3−和 THRD。春季底栖和浮游态群落分别与 SO42−, SS, CODMn 以及 pH, NO3−, TN 有着显著的相关性。零模型分析揭示, 水体和底栖致病性细菌群落的构建主要由随机过程控制, 无主导过程(漂变和弱选择等)是群落构建的主要影响因素。
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Composition and Distribution Characteristics of Potential Pathogenic Bacterial Communities in Hanjiang River
Abstract In order to analyze the composition and distribution characteristics of potential pathogenic bacterial communities in water and sediment and provide basic data for the prevention and control of pathogenic bacteria in Hanjiang River, samples were collected from 7 monitoring sections of Hanjiang River in spring and autumn of 2014. Based on 16S rRNA Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology, FAPROTAX software was used to predict the pathogenic bacteria communities, 6 categories of pathogenic bacteria were identified, belonging to 6 phyla, 9 classes, 22 orders, 45 families, 105 genera. The results showed that Proteobacteria was the main component species of pathogenic bacteria community in Hanjiang River, accounting for 96.56%, Methylopumilus and Roseomonas were dominant species at the genus level. Diversity analysis showed that pathogens were more abundant in sediment than those in surface water, and there were more apparent differences between different seasons in the plankton community. Environmental factorsrelated analysis indicated that benthic communities were more sensitive to environmental factors. Zero model analysis revealed that random processes dominated the establishment ofpathogenic bacteria communities in surface water and sediment. In summary, high-throughput sequencing technology can comprehensively and deeply present microbial community information and has great potential in the detection of pathogenic bacteria.
Key words Hanjiang River; pathogenic bacteria; community composition; influencing factors; build mechanism